黄芪多糖抗衰老作用的实验研究*

2013-03-28王振富文德鉴

中国应用生理学杂志 2013年4期

钟灵，王振富，文德鉴

（1.湖北民族学院附属民大医院，2.湖北民族学院医学院，恩施445000）

许多研究表明，自由基损伤与衰老密切相关。人参多糖、香菇多糖等许多中草药提取物能直接清除自由基，提高SOD、CAT等抗氧化酶的活性及降低MDA含量，发挥抗衰老作用［1］。黄芪为豆科多年生草本植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，性甘，微温，归脾、肺经，具有补气升阳、益卫固表、利水消肿、托疮生肌之功效，可煎服、生用或蜜炙用。黄芪为常用中药，临床常用于防治免疫功能紊乱性疾病、心脑血管疾病、促智、延缓衰老和抗肿瘤等多种疾病，疗效确切且副作用较少［2］。黄芪提取物（extract of astragalus，EA）是从黄芪中提取的有效成分，主要包括黄芪总苷（astragalosides，AST）和黄芪多糖（astragalus polysaccharides，APS）。本实验通过建立D-半乳糖小鼠衰老模型，采用碱醇提取法提取黄芪多糖，进一步研究黄芪多糖抗衰老作用及其机制，为该药在延缓衰老方面防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

D-半乳糖（中国上海慧星生化试剂有限公司）；香菇菌多糖片（武汉迪奥药业有限公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（gutathion peroxidase，GSH-Px）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；WFZ-UV2000紫外可见分光光度计（尤尼科上海仪器有限公司）；TJ270-30A红外分光光度计（天津光学仪器厂）；TGL-16G高速台式离心机（上海安亭仪器厂）；F-160型药物粉碎机（北京市永光明医疗仪器厂）；RE52-3旋转蒸发器（上海沪西分析仪器厂）。

1.2 黄芪多糖提取物的制备

采用碱醇提取黄芪多糖：准确称取黄芪饮片，黄芪与5%乙醇按1／10的量，在pH 12（碳酸钠调节）、温度为90℃的条件下提取2次，每次1.5 h，过滤，合并滤液，浓缩沉糖。冷冻干燥保存。实验前以纯水为溶剂配制不同浓度样品，4℃低温保存，备用。

1.3 实验动物分组、造模及处理

昆明种小鼠，体重28～32 g，由湖北民族学院实验动物中心提供。将60只小鼠随机分为6组，每组10只（雌雄各5只）：空白组，模型组，香菇菌多糖组和黄芪多糖低、中、高剂量组。空白组，灌胃等体积生理盐水；模型组颈背部皮下注射D-半乳糖120 mg／kg和灌胃等体积生理盐水；阳性组颈背部皮下注射D-半乳糖120 mg／kg和灌胃等体积香菇菌多糖100 mg／kg；根椐预试验确定低、中、高黄芪多糖剂量各组剂量小鼠的每日用量，分别灌胃50、100、200 mg／kg和同时颈背部皮下注射 D-半乳糖 120 mg／kg。按 0.2 ml／10 g，一天灌胃一次，连续给药60 d。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 小鼠胸腺和脾脏指数的测定末次给药24 h后，称小鼠体重，眼眶取血后处死小鼠，取胸腺、脾脏、肝脏和脑组织并称重，分别测定相关指标。按“胸腺（mg）／体质量（g）、脾脏（mg）／体质量（g）”计算胸腺指数和脾脏指数。

1.4.2 小鼠血MDA含量及SOD活力测定将小鼠血液立即离心取其血清，按丙二醛试剂盒说明书操作，于532 nm处测定各管吸光度，计算血清中丙二醛含量。按超氧化物歧化酶试剂盒说明书操作。于550 nm处测定各管吸光度，计算血清中超氧化物歧化酶活力。

1.4.3 小鼠肝组织GSH-Px活力测定取小鼠肝脏，剔去结缔组织，匀浆器研磨、加预冷的生理盐水制备成10%的组织匀浆。冷冻离心（2℃～4℃），取其上清液，用谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒测定谷胱甘肽过氧化物酶活力。

1.4.4 小鼠脑组织CAT活力测定取小鼠脑组织，加预冷的生理盐水进行匀浆制备成10%的组织匀浆。冷冻离心（2℃～4℃），取其上清液，用过氧化氢酶试剂盒测定过氧化氢酶活力。

1.5 统计学方法

实验数据用均数±标准差（¯x±s）表示，采用 SPSS 15.0软件系统进行分析，组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 黄芪多糖对衰老小鼠胸腺和脾脏指数的影响

与空白对照组比较，模型组胸腺指数和脾脏指数均有显著性降低（P＜0.05）；与模型组比较，香菇菌多糖组及黄芪多糖低、中、高剂量组胸腺指数和脾脏指数均有显著性升高（P＜0.05，P＜0.01，表 1）。

Tab.1 Effects of APSon thymus index and spleen index of aging mice（¯x±s，n＝10）

2.2 黄芪多糖对衰老小鼠MDA含量和SOD、GSH-Px、CAT活力的影响

与空白对照组比较，模型组MDA含量有显著性升高，SOD、GSH-Px、CAT活力有显著性降低（P＜0.05）；与模型组比较，香菇菌多糖组及黄芪多糖低、中、高剂量组MDA含量有显著性降低（P＜0.05），SOD和GSH-Px活力均明显提高（P＜0.01），香菇菌多糖组及黄芪多糖中、高剂量组CAT活力显著提高（P＜0.01，表2），低剂量组则差异无显著性。

3 讨论

衰老的自由基学说是Denham Harman在1956年提出的，认为衰老过程中的退行性变化是由于细胞正常代谢过程中产生的自由基的有害作用造成的。目前，自由基理论在机体衰老中的作用已受到人们的高度重视。所谓自由基（free radica1）又称游离基，就是具有未配对的原子、原子团、分子或离子叫自由基。自由基的化学性质活泼，有极强的氧化反应能力，可使各种生物膜的不饱和脂肪酸发生过氧化，形成过氧化脂质，这些产物具有一定毒性，能使蛋白质分子内和分子间发生交联，发生去氢、加成、裂解等反应，从而引起DNA的双螺旋交联出现错误或无法分裂，一些酶的活性改变，影响细胞的代谢。D-半乳糖是机体的正常营养成分，当半乳糖过多时，可由半乳糖氧化酶催化生成醛糖和过氧化氢，产生超氧阴离子自由基。过量的氧自由基可引起神经元细胞的损伤，使脑内总RNA和蛋白质含量下降，脑内神经元密度降低，造成动物学习记忆能力下降及机体的衰老［3］。许多中草药是强有力的抗氧化剂，适当补充外源性抗氧化物质，可提高机体抗氧化系统的活力，降低过氧化脂质含量，从而起到抗衰老作用。有研究表明脑的老化和慢性应激导致的小鼠空间学习记忆功能损伤与海马及前脑皮层神经元GDNF表达密切相关［4］；杭白菊总黄酮（TFCM）能显著改善 D-半乳糖衰老小鼠学习记忆能力，其机制可能与TFCM的抗氧化特性以及提高中枢胆碱能系统功能有关［5］。本实验结果显示：黄芪多糖能显著提高衰老模型小鼠胸腺指数和脾脏指数；明显降低MAD含量；提高CAT活性，以中、高剂量为宜；显著提高SOD、GSH-Px活性。提示黄芪多糖可通过增强机体免疫功能、提高机体抗氧化能力和直接清除自由基等发挥其延缓衰老的作用，但其作用机理还有待于进一步研究。