贯叶连翘提取物对扩张型心肌病大鼠缝隙连接蛋白Cx43的影响*

尚 好，钱雅珍，陶厚权，李 乐△

（1.浙江工业大学药学院，杭州310032；2.杭州市拱墅区小河湖墅地段社区卫生服务中心药剂科，浙江杭州310011；3.浙江省人民医院中心实验室，杭州310032）

细胞缝隙连接是心肌细胞间唯一具有电连接作用的细胞间连接形式，通过缝隙连接蛋白43（connexin 43，Cx43）等进行信息和能量物质的交换，并对细胞新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程起重要的调控作用。

贯叶连翘提取物（hypericum perforatum extract，HPE）为藤黄科植物贯叶连翘的带花全草提取物（主要成分有金丝桃素、金丝桃苷等），用作中枢神经抑制剂和抗忧郁剂。扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）是一种严重危害人们健康的心肌类疾病，以胶原组织增多和间质纤维化为主要病理特征并常伴有电生理紊乱［1］，在临床上主要为心腔扩大、心律失常以及心力衰竭。目前DCM的发病机制还不清楚。研究证明，心肌炎与DCM的发病存在密切的关系，通常认为心肌炎是DCM的主要前驱表现［2］。我们课题组在前期研究中证实HPE有较好的抗免疫性心肌炎作用基础上，本实验采用阿霉素腹腔注射诱导Wistar大鼠DCM模型，探讨HPE对DCM心肌缝隙连接蛋白Cx43的作用。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂

注射用盐酸多柔比星（浙江海正药业股份有限公司，批号20120101）；贯叶连翘提取物（福州日冕科技开发有限公司），生理盐水配成5%浓度的溶液；Trizol试剂 （Ambion公司）；逆转录试剂盒、SYBR Premix PCR试剂盒（TaKaRa公司）；兔抗Cx 43抗体（Cell Signaling Technology公司）；PCR引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

1.2 动物模型制备及治疗给药

健康Wistar雄性大鼠56只，体重200～215 g，购于上海西普尔-必凯实验动物公司，合格证号2008001617932。将大鼠随机分成正常组（n＝10），模型组（n＝46），模型组大鼠每周腹腔注射盐酸多柔比星（阿霉素）3.0 mg／kg，连续 6周，停药观察2周，正常对照组对应给予等量生理盐水。第9周将模型组存活的大鼠根据眼眶血浆脑钠肽激素（BNP）水平、体征、腹水等指标，将存活的大鼠分为DCM组和治疗组，治疗组HPE灌胃给药剂量100 mg／kg，每天2次，连续30 d，正常对照组及DCM组对应给予等量生理盐水。

1.3 切片染色检测

治疗结束后，无痛处死大鼠，取心脏心尖左心室部分于10%的福尔马林的固定液中，根据HE、Masson染色步骤，分别将大鼠心肌切片染色，观察。

1.4 Envision二步法免疫组化检测Cx43蛋白表达

切片脱蜡至水、孵育、加一抗、苏木精染色、切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明、中性树胶封存，晾干后观察。在×400光镜下，每组6只动物，每只动物做6张切片，每张切片选取5个视野，利用 Image Pro Plus（IPP）6.0版本软件，根据染料颜色深浅的值和阳性表达面积来确定Cx43蛋白的量，测量图片阳性表达面积（area）和平均光密度（OD值）。

1.5 RT-PCR反应检测Cx43 mRNA

采用Trizol一步法提取大鼠心室的总RNA，超微量分光光度计检测OD260／OD280值，根据引物设计的原则，设计合成Cx43和内参照β-actin的引物，Cx43引物：F：5’-GAAGCACCATCTCCAACTCGC-3’， R：5’-CGTTGGTCCACGATGGCTAAT-3’，长度为 115 bp；β-actin引物：F：5’-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，R：5’-CATTGCCGATAGTGATGACCT-3’，长度为143 bp。扩增条件：（1）预变性：95℃，4 min；（2）变性：95℃，10 s；（3）退火延伸：56℃，20 s，共 40个循环，进行 RT-PCR反应。

1.6 统计学处理

所有数据用均数±标准差（¯x±s）表示，采用 SPSS 19.0专业统计软件进行数据分析处理。各组间采用单因素方差分析，两组间用LSD法。

2 结果

2.1 大鼠存活情况

整个造模过程中，正常对照组全部存活，造模期间DCM模型组大鼠第三周开始普遍出现活动减少，厌食，体重下降明显，血性胸腹水，部分出现前肢出血，且有腹水的大鼠在两周内死亡，总体死亡率为34.8%，尸检观察大鼠死亡可能与心力衰竭有关。HPE治疗一月后，上述症状缓解，死亡率明显降低（23.1%／47.1%，P＜0.01）。

2.2 大鼠病理切片观察

Masson染色显示胶原纤维呈蓝色，细胞质、肌纤维和红细胞呈红色，细胞核呈蓝褐色，DCM组心肌纤维排列紊乱，间质胶原沉积布满心肌间隙，间质胶原沉积明显多于正常组和治疗组，显示DCM大鼠严重心肌纤维化（图1）。

Fig.1 Expression of collagen in the myocardium of rat（Masson×100）

2.3 免疫组化半定量Cx43蛋白表达量

Envision法免疫组化显示棕黄色为Cx43蛋白表达染色，紫色为细胞核，正常组阳性着色点分布规律且广泛，大多数分布在心肌纤维长轴垂直的端-端连接处，DCM组仅可见大量蓝色的细胞核，仅有少量的棕黄色阳性部分表达且存在侧-侧连接，治疗组着色颗粒明显，分布较DCM更有序（图2）。

Fig.2 Expression of Cx43 in left ventricular of rat（Envision×400）

正常组可见大量的Cx43阳性表达；DCM组的Cx43表达较正常组明显减少（P＜0.01），而且分布稀疏，颜色浅淡；HPE治疗组的Cx43表达较 DCM组明显增多（P＜0.05），颜色深染，而且分布均匀有规律（表1）。

2.4 Cx43 RT-PCR结果

应用Mx 3000PReal Time PCR扩增仪完成扩增后，根据2-△△△Ct法原理计算相对定量，Cx43目的基因的相对表达量＝2-（Cx43Ct-β-actinCt），表 2为各组大鼠心肌 Cx43 mRNA表达量的变化，图3为各组样本扩增曲线。

Tab.1 Indicators of myocardial tissue Cx43 protein expression（¯x±s，n＝7）

Fig.3 Amplification curve of Cx43 mRNA

与正常组相比，DCM组Cx43 mRNA的表达显著降低（P＜0.01）。与DCM组相比，治疗组大鼠Cx43 mRNA的表达升高明显，差异具有统计学意义（P＜0.01，表2）。

Tab.2 Changes in myocardial tissue expression of Cx43 mRNA（¯x±s，n＝7）

3 讨论

Cx43是心室缝隙连接最重要的蛋白，主要分布于闰盘，参与和影响心脏电生理活动，包括电激动的传导速度、心肌电偶联等，若Cx43数量及结构变化可引起通道电阻增加，纵向传导受阻，传导速度严重下降，传导的各向异性发生显著变化。这些改变将导致传导阻滞和折返传导，诱发心律失常［3］。扩张型心肌病大鼠心衰时，Cx43在心肌细胞上的表达减少、个体减小和分布异常引起的心室缝隙连接蛋白Cx43重构，导致电位失偶联增加，心室肌细胞除复极时间延长，易诱发心律失常。

病理过程中AngⅡ升高激活PKC活性，诱使Cx43磷酸化，加快Cx43的降解，使得心律失常易感性增加。而PKA的激活则在通过诱导Cx43磷酸化的情况下，使得Cx43的表达增加［4］，但具体机制尚未明确。本研究发现 DCM组大鼠Cx43蛋白以及Cx43 mRNA表达显著减少，虽然扩张型心肌病过程中AngⅡ升高过程促发Cx43表达增加，但扩张型心肌病过程长期交感神经兴奋使得包括去甲肾上腺素（NA）在内的儿茶酚胺积聚，在心衰早期，去甲肾上腺素浓度升高刺激β受体活化，但随着NA浓度的进一步上升，β受体密度下调且配体-受体开始解偶联，β受体系统脱敏使得 Cx43表达减少［5］。

DCM引起心脏的前后负荷增加，机体在应激条件下作相应的代偿反应，若得不到及时的治疗，易引起心肌能量产生与利用障碍，进一步的心肌纤维化引发心室重构，而Cx43的表达减少及分布异常可看作分子水平的心脏重构，最终因不可逆性的心力衰竭死亡。实验结果表明，HPE治疗后，明显降低DCM大鼠死亡率，大鼠心肌组织Cx43蛋白及Cx43 mRNA表达显著升高，可能有助于缓解DCM大鼠心力衰竭，HPE是如何影响Cx43表达的机制需进一步研究。

［1］ van der Zwaag PA，van Rijsingen IA，Asimaki A，et al.Phospholamban R14del mutation in patients diagnosed with dilated cardiomyopathy or arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy：evidence supporting the concept of arrhythmogenic cardiomyopathy［J］.Eur J Heart Fail，2012，14（11）：1199-1207.

［2］ 杨克平，张云峰，李 欣.扩张型心肌病患者Thl7／Treg的变化及意义［J］.微循环学杂志，2011，21（1）：32-34.

［3］ 窦光华，何维来.Cx43连接蛋白与心脏发育［J］.心脏杂志，2011，23（2）：260-262.

［4］ Miura T，Yano T，Naitoh K，et al.Delta-opioid receptor activation before ischemia reduces gap junction permeability in ischemic myocardium by PKC-epsilon-mediated phosphorylation of connexin 43［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293（3）：H1425-1431.

［5］ Boengler K.Stimulation of cardiac beta-adrenoceptors targets connexin 43［J］.Br J Pharmacol，2009，158（1）：195-197.