β3受体阻断剂对心力衰竭大鼠心肌解偶联蛋白2和能量代谢变化的影响*

高艳辉，高海波，狄宁宁，孔一慧△，李为民

（1.哈尔滨医科大学附属第一医院心内科，黑龙江哈尔滨150001；2.哈尔滨工程大学医院内科，黑龙江哈尔滨150001）

心力衰竭（heart failure，HF）是许多心血管疾病的终末阶段，心肌能量代谢障碍在其发生发展过程中起到重要作用［1］。解偶联蛋白 2（uncoupling protein 2，UCP2）作为线粒体内膜的质子转运体，可以将内膜外侧的H＋运回内侧，降低物质氧化过程中H＋形成的膜两侧电化学梯度，解除呼吸链氧化磷酸化和ATP合成的偶联，使H＋氧化过程中释放出的能量转化为热能，ATP生成减少［2］。HF时心肌β3-受体（β3-adrenergic receptor，β3-AR）表达增加约 2～3倍，且过多激动，有文献报导β3-AR激动剂能使平滑肌组织中UCP2表达上调［3］，因此本实验通过HF大鼠模型，观察HF时心肌β3-AR、UCP2表达及心肌能量代谢变化，探讨β3-AR阻断剂是否通过降低UCP2表达，改善HF时心肌能量代谢和心脏功能。

1 材料与方法

1.1 心力衰竭大鼠模型建立与分组

雄性 Wistar大鼠60只，体重（200±20）g，购自哈尔滨医科大学附属第一医院动物实验室，随机分成2组，对照组7只，HF组53只。HF组给予异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO，美国 Sigma公司）340 mg／kg皮下注射2次，间隔24 h。8周后，HF组存活39只大鼠，存活的 HF大鼠随机分成 2组：（1）ISO＋SR59230A组：21只，SR59230A（85 nmol溶于 1 ml生理盐水，美国Sigma公司），每日2次腹腔注射，共6周；（2）ISO组：18只，ISO组给予相应生理盐水 1 ml，每日2次腹腔注射。对照组不予处置。治疗6周后ISO组和 ISO＋SR59230A组分别死亡9只、3只大鼠。随机选取两组中左室射血分数（LVEF）＜70%的大鼠7只与对照组比较。

1.2 心脏超声检查

将大鼠用水合氯醛（100 mg／kg）腹腔注射麻醉后，取左侧卧位，应用探头频率为12 MHz进行心脏超声检查。取胸骨旁左室长轴切面，用M型超声测定左室舒张末期直径（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左室收缩末期直径（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、短轴缩短率（fraction shortening，FS）、射血分数（ejection fraction，EF）等指标，测定值均为连续5个心动周期测得的均值。

1.3 左室重量与体重比值测定

麻醉后测定大鼠体重，开胸取出心脏用PBS冲去残血，滤纸吸干表面，分离左室，测定左室重量／体重（left ventricle weight／body weight，LVW／BW）。

1.4 RT-PCR方法测定心肌组织β3-AR、UCP2 mRNA表达

应用Trizol法提取总RNA，应用逆转录试剂盒按说明PCR仪扩增，电泳后应用凝胶成像系统分析处理，计算β3-AR、UCP2mRNA与GAPDH mRNA灰度比值（引物由南京金思特科技有限公司合成），各指标引物序列、退火温度见表1。

Tab.1 Reaction conditions of UCP2，β3-AR and GAPDH mRNA by RT-PCR method

1.5 Western blot测定心肌组织UCP2蛋白表达

取大鼠心肌组织约300 mg匀浆提取线粒体蛋白，按考马斯亮蓝试剂盒操作检测蛋白浓度。SDS PAGE（十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺）凝胶电泳。取各组蛋白50μg使其变性。电泳后转膜，转膜后用丽春红S染膜，观察转移效果。将膜用PBS液（成分：Na2HPO4、NaH2PO4和 H2O，pH 7.4）洗 3遍，加入一抗（英国Abcom公司），4℃封闭过夜，第2天加入二抗（北京中杉生物技术有限公司）37℃1 h后显色。

1.6 高效液相色谱法测定心肌组织ATP、PCr含量

取大鼠心肌组织约100 mg匀浆，离心。色谱条件：C18柱（250 mm×4.60 mm，粒径5μm），流动相为50 mmol／L的磷酸盐-甲醇缓冲液（pH 6.0），流速 1 ml／min，柱温为室温 25℃，ATP和 PCr检测波长分别为254 nm和210 nm，进样量20μl。根据一系列已知浓度的样品以浓度对峰面积作回归处理绘制标准曲线，然后测定各组大鼠心肌组织ATP、PCr含量。

1.7 统计学分析

所有指标以均数 ±标准差（¯x±s）表示，应用SPSS10.0软件进行统计学处理，检验资料符合正态分布，组间具有方差齐性再进行单因素方差分析（One-way ANOVA），组间比较采用 q检验。

2 结果

2.1 心脏超声

M型超声测定其LVESD及LVEDD、EF，并计算FS值，结果显示造模成功的大鼠心功能较对照组明显下降。与对照组比较，ISO组、ISO＋SR59230A组LVESD及LVEDD明显增大，LVEF及FS则明显降低（P均 ＜0.01）；ISO＋SR59230A组与 ISO组比较，LVEDD以及LVESD减小，LVEF及FS升高（P均＜0.05，表 2）。

Tab.2 Results of echocardiography（¯x±s，n＝7）

2.2 心室重构指标测定结果

与对照组相比，ISO组和 ISO＋SR59230A组LVW增大，BW降低，但各组间比较无统计学意义（P＞0.05），而 LVW／BW明显增大（P＜0.01）；与ISO组比较，ISO＋SR59230A组LVW／BW降低（P＜0.05，表 3）。

Tab.3 LV weight，body weight and ratio of LV weight and body weight（¯x±s，n＝7）

2.3 RT-PCR测定心肌组织β3-AR、UCP2 mRNA表达

β3-AR mRNA及UCP2mRNA变化趋于一致。与对照组相比，ISO组β3-ARmRNA及UCP2mRNA显著增加（P＜0.01），与 ISO组相比，ISO＋SR59230A组β3-AR mRNA及 UCP2mRNA减少（P＜0.05，图 1、表4）。

Fig.1 GAPDH，UCP2 andβ3-AR mRNA expression by RT-PCR in left ventricular UCP2：Uncoupling protein 2；β3-AR：β3-adrenergic receptor A，B，Care mRNA expression results by RT-PCRfor GAPDH，UCP2，β3-AR；M：DNA Marker；1：Control group；2：ISO group；3：ISO＋SR59230A group

Tab.4 Ratio ofβ3-AR，UCP2 and GAPDH mRNA level by RTPCR（¯x±s，n＝7）

2.4 心肌组织UCP2蛋白表达

ISO组大鼠心肌组织UCP2蛋白表达明显上调（P＜0.05）。与 ISO组比较，SR59230A干预可以下调 UCP2蛋白表达（P＜0.05，图 2），但其仍高于对照组。

Fig.2 UCP2 protein expression by Western blot in left ventricular UCP2：Uncoupling protein 2；M：DNA Marker；1：Control group；2：ISO group；3：ISO＋SR59230A group*P＜0.05 vs control group；＃P＜0.05 vs ISO group

2.5 ATP and PCr水平

ATP在各组心肌中含量没有明显差异，但是与对照组比较，ISO组和ISO＋SR59230A组PCr含量明显减少（P均 ＜0.01），PCr／ATP降低（P＜0.01，P＜0.05），与 ISO组比较，SR59230A干预可抑制 PCr含量和 PCr／ATP下降（P均 ＜0.01，表 5）。

Tab.5 Content of myocardium ATPand PCr of every group（¯x±s，n＝7）

2.6 心肌组织UCP2蛋白表达与PCr／ATP相关性分析

心肌组织UCP2蛋白表达与PCr／ATP呈显著负相关（r＝-0.82，P＜0.01，图 3）。

Fig.3 Correlation analysis between myocardial UCP2 protein expression and the ratio of PCr／ATP UCP2：Uncoupling protein 2；PCr：Creatine phosphate

3 讨论

确切动物模型的建立是动物实验的首要条件之一。ISO是心肌毒性最强的一类儿茶酚胺，有研究表明较大剂量（＞85 mg／kg）的ISO可以造成心肌弥漫性坏死，并逐渐进展为扩张型心肌病HF。本文应用大剂量（340 mg／kg）ISO后，对实验大鼠进行心脏超声方面检测，发现ISO组心功能较正常大鼠明显恶化，与文献报道相似［4］。

研究发现激动β3-AR可引起平滑肌和脂肪组织UCP2表达上调［3］，本研究证实 HF大鼠心肌β3-AR和UCP2表达上调，通过 SR59230A阻断β3-AR后UCP2表达下降，提示HF时UCP2表达上调与β3-AR上调和过多激动相关，具体机制尚不清楚，可能与HF时β3-AR过多激动引起ROS和FFA增加有关。HF时，大鼠心肌β3-AR上调，氧化应激指标明显增强［4］，ROS可上调 UCP2表达并使其活性增强［2］，提示本实验UCP2表达增加与β3-AR上调，ROS增加有关；β3-AR激动发挥脂解作用，HF大鼠心肌β3-AR上调，血浆 FFA含量增加［5］，血浆 FFA增高可上调UCP2mRNA表达［2］，提示UCP2表达增加可能与HF大鼠β3-AR上调，血浆FFA增加有关。SR59230A通过能阻断β3-AR，降低脂解作用，减少血浆FFA，减少HF大鼠心肌氧化应激水平，因此推断本实验SR59230A下调心肌UCP2表达可能是通过上述共同作用的结果。另外，邹原等研究发现胃迷走神经切除后，UCP2表达上调，说明HF时UCP2表达增加也与交感神经兴奋有关［6］。

心脏是一个高耗能器官，ATP直接供能，PCr则储存能量，二者相互转化。本研究发现，HF大鼠心肌UCP2表达增加，解偶联作用增强，反应向能量储备方向减少，生成 PCr减少，PCr／ATP比值降低，相关性分析发现UCP2表达与PCr／ATP比值呈明显负相关，提示HF时 PCr含量减少、PCr／ATP降低与心肌UCP2表达上调有关，应用β3-AR阻断剂主要通过减少UCP2表达改善能量代谢，增加ATP的生成，增加能量储备。另外其他机制也可能参与心肌能量代谢障碍这一过程，HF时，ROS产生增加，可抑制线粒体呼吸链酶复合物，还可引起线粒体DNA的损伤，进而引起能量障碍［7］，β3-AR阻断剂通过抑制氧化应激［4］从而改善能量代谢。

本研究证实SR59230A改善HF大鼠心脏功能，机制可能是阻断β3-AR和下调UCP2表达共同作用的结果。β3受体与Gi蛋白相连，刺激一氧化氮合酶（NOS），促进一氧化氮（NO）产生，细胞内环磷酸鸟苷（cGMP）增加，降低心肌收缩力［8］，SR59230A可阻断此作用，从而改善心脏功能；另一方面，HF时心肌UCP2的表达，引起能量代谢障碍，不论心肌的收缩和舒张均是一个耗能的过程，能量代谢异常将恶化心脏功能，同时Turner等发现UCP2表达增加，线粒体膜电势降低，对胞浆Ca2＋摄取减少，导致舒张期Ca2＋的消散延长，易化了钙活化的产生，可产生局部不同步的钙释放，恶化心肌兴奋-收缩偶联［9］，对心功能产生不利影响，而这一作用是独立于能量代谢障碍，SR59230A通过下调UCP2的表达改善心脏功能；此外，SR59230A通过下调β3受体和 UCP2，降低了LVW／BW比值，改善心脏结构重构指标，改善心脏功能。

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