二联苯碘合并谷氨酰胺干预对过度训练引起的中性粒细胞功能的调控及机制研究*

董静梅，陈佩杰

（1.同济大学体育教学部 上海200092；2.上海体育学院 上海200438）

过度训练（overtraining，OT）引起的运动性免疫抑制与过氧化损伤是影响运动员身体健康，困扰运动员提高运动水平的难点问题，谷氨酰胺（glu-tamine，Gln）作为细胞能量代谢的底物，可有效提高运动员的运动能力［1］。但一个不容忽视的问题是：运动本身可引起的活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生，而运动时Gln的补充在给予细胞能量的同时，又增加了体内组织细胞内源一氧化氮（nitric oxide，NO）的大量产生，这样活性氧、活性氮的双重因素可引起细胞的氧化损伤而导致细胞功能水平的下降［2］，前期的研究证明：运动时NADPH氧化酶是运动引起的细胞非特异免疫功能变化的调控靶点［3］。基于此，本研究首次采用NADPH氧化酶抑制剂DPI与Gln补充作为合并干预的手段，分析探讨过度训练及其单纯补充Gln与合并干预对机体氧化水平的影响及机制，以达到逆转过度训练引起的中性粒细胞过氧化损伤，为防护运动性免疫抑制的方法学提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

四甲基乙二胺（TEMED），二硫苏糖醇（DTT），甘氨酸（G）购自美国Promega公司；蛋白Marker由中科院上海生物化学研究所监制；苯磺酸（BSA）十二烷基硫酸钠（SDS）三羟甲基氨基甲烷（Tris）均购自上海迪奥生物科技有限公司。谷氨酰胺（Gln）购自美国Sigma公司。一抗gp91phoxrabbit polyclonal IgG和P47phoxGoat polyclonal IgG及二抗rabbit polyclonal to Goat IgG-HRP、Goat polyclonal to Rabbit均购自美国Santa cruz公司；本实验所有血液指标试剂盒均购自碧云天生物科技有限公司；呼吸爆发和吞噬功能检测试剂盒购自德国Glycotope Biotechnology公司。

1.2 实验动物及分组

50只雄性 Wistar大鼠（体重 225±6.7g），适应性喂养一周后（环境温度20℃～25℃，每天光照时间保证12 h，自由饮食水）。随机取8只作为安静对照组（C），其余继续进行4周的适应性跑台训练后，随机分为4个组（n＝8）：单纯过度训练组（E）、过度训练 DPI干预组（D）、过度训练谷氨酰胺干预组（G）、过度训练与DPI合并谷氨酰胺干预组（DG）。

1.3 训练模型

整个训练模型在参照巴西Hohl的方法［4］的基础上，在最后一周的训练时间延长至大鼠力竭，力竭的标准以大鼠四肢无力支持住身体、头部低垂、电刺激后不能继续正常奔跑为力竭标准，成功建模的标准以同安静组比较，单纯过度训练组大鼠血浆皮质醇和睾酮在统计学意义上的显著降低为据。

1.4 给药时间及剂量

从第5周开始，D组在训练前半小时腹腔注射DPI（Sigma，产品编号：D2926），给予浓度与方法参考［5］，G组参考金其贯的方法给予L-谷氨酰胺（Sigma，产品编号：G-3126）进行干预［6］，DG组按相同剂量与方法给予DPI与谷氨酰胺，同时E组给予与D、G组相同方法相同剂量的安慰剂（即DPI与Glu的稀释液分别为5%葡萄糖注射液和0.9%生理盐水（上海医药产））。

1.5 血样收集

过度训练指标的血样采取：在第十一周大鼠训练的最后两天的次日早晨用毛细管取C组、E组大鼠眼眶静脉丛血0.2 ml（EDTA抗凝），立即分离血浆用于皮质醇（cortisol，T）和睾酮（corticosterone，Cort）的检测。

过度训练后采血：为避免运动应激和麻醉剂对实验结果的影响，这次采血所有大鼠均保证在末次训练的36～40 h内眼眶静脉丛取血3 ml血液分装在EDTA抗凝管（0.5 ml，标记为A管）和肝素抗凝管（2.5 ml，标记为 B管）后立即断头处死。

1.6 中性粒细胞的分离与冻存

按多型核细胞分离液说明书取分离液1 ml与离心管中，将等比的1 ml血液小心铺与分离液液面上后离心（450 g，35 min，18～22℃），分别用吸管吸取取中性粒细胞与淋巴细胞分离层后用0.45%NaCI低渗液洗两次，用PBS洗一次后加入0.4%胎盼蓝染色计数，调细胞浓度为1×107cells／ml，使制备好的活细胞数不低于96%后悬浮于预冷的适量RPMI-1640培养液后分取 500μl离心（2 500 r／min、5 min、4℃），弃上清，收集中性粒细胞冻存在-80℃以备测定蛋白浓度及Western blot实验。

1.7 血浆指标的测定

中性粒细胞趋化因子（cytokine-induced neutrophil chemoattractant，CINC）、白介素-1β（interleukin，IL-1β）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein，MCP-1）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）、粒细胞集落刺激因子 （granulocyte colonystimulating factor，G-CSF）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、丙二醛（MDA）以及皮质醇，睾酮等指标的测定按酶联免疫试剂盒（ELISA KIT）测定步骤进行。

1.8 NADPH氧化酶关键亚基gp91phox与 p47phox的蛋白印迹的测定

取出冻存的中性粒细胞，在冻融后分别加入PBS溶液1 ml，将样品稀释至已测定的总蛋白含量，取200μl样品加入50μl 5×SDS上样 buffer，95℃处理10 min后电泳。电泳约40 min后等到溴酚蓝跑出分离胶即可停止电泳，用buffer平衡10 min后按规定的顺序依次放好胶、膜及滤纸进行转膜。转膜后加入 anti-gp91phox、anti-p47phox（一抗）过夜，洗脱，再分别加入二抗摇床孵育1 h后，DAB显色液显色，TANON GIS-2008凝胶成像仪灰度扫描，GIS凝胶图像处理系统进行数据分析，测定目标条带面积和灰度值，通过目标蛋白与内参对比进行半定量分析，目标蛋白含量＝条带面积×平均灰度，蛋白半定量值＝目标蛋白含量／β-actin蛋白含量。

1.9 统计学分析

所有测试结果以平均数±标准差（¯x±s）表示，用SPSS 11.5软件分析处理，进行单因素方差分析的LSD对比分析；Pearson相关分析用于NADPH氧化酶活性与MPO、MDA的相关性分析；Stepwise法对中性粒细胞功能变化、NO生成与NADPH氧化酶活性之间的关系进行回归分析。

2 结果

2.1 过度训练后DPI合并Gln补充后血浆细胞因子的变化

同安静对照组比较，过度训练后E组血浆各细胞因子浓度均显著性上升，其中 IL-1β、IL-6、CINC、GCSF达到非常显著性水平；DPI干预组（D）除 IL-1β显著下降（P＜0.01，表 1）。Gln补充组（G）中除 NO显著上升外，其余细胞因子的变化基本同过度训练组（E）。而DPI合并 Gln补充组（DG）中只有 NO和CINC显著增加，其余各组的细胞因子浓度无显著变化。过度训练组、Gln补充组（G）中血浆 IL-1β、IL-6、TNF-α等这些炎性因子及G-CSF的表达增加，说明过度训练可引起细胞炎性因子的分泌及中性粒细胞大量的募集而诱发炎症的发生，DPI具有显效的抑制这些炎症因子的增加作用，同时Gln补充组（G）和DPI合并Gln补充组（DG）中血浆NO的水平均显著增加，其中G组具有极其显著性统计意义。

Tab.1 Concentration of cytokine in plasma after overtraining（¯x±s，n＝8）

2.2 DPI合并Gln补充大鼠过度训练后血浆过氧化水平的变化

通过实施DPI干预合并Gln补充，大鼠过度训练后血浆MDA（图1）同安静对照组相比，过度训练组（P＜0.01）及 Gln补充组（G）显著上升（P＜0.05），DPI干预组（P＜0.05）及 DPI合并 Gln补充组（DG）（P＜0.01）则显著低于过度训练组。

2.3 DPI合并Gln补充大鼠过度训练后血浆MPO及NADPH氧化酶活性的变化

图2所示的大鼠过度训练后各组血浆MPO的水平（图2A）及NADPH氧化酶（图2B）两指标的变化基本相同，同安静组比较，过度训练组（E）与Gln补充组（G）的中性粒细胞活性均升高（P＜0.05），而DPI干预组及DPI合并Gln补充组（DG）显著低于过度训练组（P＜0.01），说明DPI能有效抑制中性粒细胞的激活和NADPH氧化酶，而DPI合并Gln补充组对中性粒细胞激活和NADPH氧化酶的抑制效果更为显著。

Fig.1 Concentration of MDA in rat plasma after overtraining C：Control group；E：Overtraining group；D：Administration group；G：Glutamine supplementation group；DG：Combined DPI and glutamine group；MDA：Malondialdehyde

2.4 DPI干预合并Gln补充大鼠过度训练后离体外周血中性粒呼吸爆发和吞噬功能的变化

过度训练后各组中性粒细胞呼吸爆发的氧化细胞百分比与平均荧光强度的检测结果显示（图3A）：同安静对照组比较，大鼠中性粒细胞呼吸爆发的氧化细胞百分比与平均荧光强度同步在单纯过度训练组（E）显著降低（P＜0.05），DPI干预组（D）与 Gln补充组（G）两者也有降低但未达到显著性水平。但各组同过度训练组（E）相比，DPI干预组（D）、Gln补充组（G）及其 DPI合并Gln补充组（DG）的呼吸爆发氧化细胞百分比与平均荧光强度则有同步上调的趋势，并且DPI合并Gln补充组（DG）中性粒细胞呼吸爆发的上调达到显著性水平（P＜0.05）。

Fig.2 Concentration of MPO and the activity of NADPH-oxidase after overtraining

Fig.3 Changes of the neutrophils function after overtraining in five groups

而过度训练后各组中性粒细胞吞噬功能检测结果与呼吸爆发功能完全不同的是（图3B）：同安静对照组（C）相比，过度训练组（E）的吞噬功能显著降低达到非常显著性水平，但DPI干预组（D）、Gln补充组（G）及其DPI合并Gln补充组（DG）的吞噬功能则无显著变化，但与过度训练（E）组比较，DPI干预组（D）、Gln补充组（G）及其 DPI合并 Gln补充组（DG）三组的吞噬功能则有程度不一的升高，其中DPI合并Gln补充组（DG）的升高达到非常显著性水平（P＜0.01）。此结果说明过度训练可引起中性粒细胞吞噬功能的显著下降，而单纯DPI和Gln有逆转其功能下降的趋势，但DPI和Gln的合并干预能更有效的逆转。

2.5 过度训练后DPI干预合并Gln补充大鼠中性粒细胞NADPH氧化酶关键亚基gp91phox和p47phox的蛋白表达

过度训练后利用Western blot方法测定各组大鼠中性粒细胞中NADPH氧化酶关键亚基gp91phox和p47phox蛋白表达的结果显示：同安静组（C）比较，过度训练组（E）中大鼠中性粒细胞 NADPH氧化酶gp91phox和 p47phox的表达均显著上调（P＜0.01），而除了DPI合并Gln补充组（DG）的 gp91phox的蛋白表达显著下调（P＜0.05）外，其余各组的 gp91phox和p47phox蛋白表达均无显著性变化；但同过度训练组（E）比较 DPI干预组（D）、Gln补充组（G）及 DPI合并Gln补充组（DG），无论是 gp91phox还是 p47phox的蛋白表达均显著下调，甚至在DPI合并Gln补充组（DG）的gp91phox的蛋白表达下调达到了非常显著性水平（图4）。这说明过度训练可引起中性粒细胞的NADPH氧化酶关键亚基gp91phox和 p47phox的蛋白表达上调，而单纯的DPI干预和Gln的补充可抑制这种上调的趋势，两种合并干预可有效的抑制这种由于过度训练引起的NADPH氧化酶关键亚基gp91phox蛋白表达的上调。

Fig.4 Expression of gp91phox and p47phox of NADPH-oxidase in neutrophils induced by overtraining

3 讨论

3.1 过度训练对中性粒细胞功能的影响

过度训练作为一种刺激可诱发一系列的生理及免疫功能的综合反应进而影响到运动员正常运动技能的发挥。本研究前期［7］对过度训练后中性粒细胞的凋亡，淋巴细胞的DNA损伤以及中性粒细胞体外呼吸爆发与吞噬功能进行测定发现：过度训练激活NADPH氧化酶而使中性粒细胞产生和氧化应激［7］。而本实验的研究揭示：过度训练可引起外周血浆炎性因子、趋化分子分泌增加，中性粒细胞募集及外渗相关的黏附蛋白的表达上调等可诱发周围组织炎症的发生；同时过度训练后NADPH氧化酶关键亚基gp91phox和 p47phox的蛋白表达均显著上调，根据这两种蛋白移位至质膜上的共定位分子迁移理论［8］证明：过度训练激活中性粒细胞NADPH氧化酶而引起呼吸爆发产生ROS。而这些炎性因子及ROS的产生又可反馈性的激活NADPHA氧化酶引发中性粒细胞的过度激活，产生过多的ROS，因而引起中性粒细胞的凋亡甚至坏死从而导致中性粒细胞呼吸爆发和吞噬功能的降低。

3.2 中性粒细胞的谷氨酰胺代谢及补充对中性粒细胞功能的影响

谷氨酰胺在细胞能量代谢中的作用早已被大家所认同，大量的体外孵育处理和在体实验均提示谷氨酰胺在调节细胞的黏附和中性粒细胞迁移中具有重要作用。本实验发现补充谷氨酰胺有提升中性粒呼吸爆发和吞噬功能改变的趋势；而补充谷氨酰胺组NADPH氧化酶关键亚基gp91phox和 p47phox的蛋白表达未有变化可以断定谷氨酰胺的补充对激活中性粒细胞NADPH氧化酶无显著的作用，但可有效逆转由于过度运动引起的中性粒细胞呼吸爆发与吞噬功能。

但较为矛盾的是过度训练状态下线粒体活性氧生成增多［9］，血液中 IL-6、G-CSF的浓度增加，血浆过氧化水平的增加、MPO及NADPH氧化酶活性的增加，而补充谷氨酰胺在理论上本身可以引起ROS产生增加，这岂不引起谷氨酰胺与过度训练叠加的ROS生成增多而导致机体过氧化损伤增加吗？我们实验数据表明，补充谷氨酰胺后并不能有效的缓减过度训练引起的血浆中炎性因子的增加，如IL-6、CINC、G-CSF，却可以明显提升由于过度训练引起的NO的减少，但血浆过氧化水平、MPO及NADPH氧化酶的活性同过度训练组比较有下降的趋势。

3.3 中性粒细胞中 iNOS介导产生的 NO与NADPH氧化酶的消长性关系

NO是L-精氨酸和氧分子在诱导性一氧化氮合酶（iNOS）的作用下利用NADPH提供的电子而合成的。补充NO的供体Gln可减少中性粒细胞在血管内皮的黏附而加速其在血管中的移行，同时由于中性粒细胞NO代谢中谷氨酰胺作为氮的供体可增加内源性NO的生成而调控内皮功能信号分子的作用。但由于NO共用NADPH提供电子，NADPH氧化酶与NO之间有相互抵御的消长作用，也就是说中性粒细胞中NADPH氧化酶活性增加会抑制iNOS的活性而减少NO的产生，而NO的过度产生又可抑制机体中NADPH氧化酶活性而减少此途径产生的ROS，这两种因素相互抵消的矛盾在最近的 Chen（2010）糖尿病研究报道中也有体现［10］。据此推测过度训练时补充Gln在增加NO生成的同时抑制了NADPH氧化酶的活性，从而减少由NADPH氧化酶途径产生的ROS，而单纯补充Gln过度训练后ROS的生成主要是iNOS介导生成的过量的NO所致。因此运动时单纯补充Gln可引起NO的大量生成而出现新的自由基损伤。

3.4 DPI合并Gln补充对过度训练引起的中性粒细胞功能下降的逆转作用及机制分析

本研究对大鼠中性粒细胞NADPH氧化酶关键亚基gp91phox和p47phox的蛋白表达的检测表明：DPI合并Gln可适度有效抑制NADPH氧化酶的活性而产生适度的ROS，而过度训练后而与之有消长关系的血浆NO浓度却显著增加，因此我们有理由推测DPI合并Gln补充可能一方面从活性氧产生途径上抑制中性粒细胞NADPH介导产生过多的ROS，另一方面从Gln固有的对细胞补充能量的角度出发来实施对细胞免疫的调理作用，而且由于NO与NADPH氧化酶的消长性关系，过度训练引起的内源性NO的增多也可反馈性降低NADPH氧化酶使两者达到某种平衡。因此DPI合并Gln补充针对过度训练引起的血液过氧化水平、中性粒细胞的过度激活，中性粒细胞呼吸爆发与吞噬功能的降低具有显著的逆转作用。

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