小鼠脑缺血/再灌注后细胞周期相关蛋白在神经元的表达规律

乔海兵，尚君璟，接 近，兰依娜，赵 亮，史志远，石 静(山西医科大学汾阳学院解剖学教研室，汾阳0300;山西医科大学汾阳学院)

缺血性脑血管疾病是危害人类生命和健康的常见病和多发病，具有发病率高、致残率高等特点。因此，对于缺血性脑血管疾病的机制和治疗的研究显得尤为重要。局灶性脑缺血后可引起继发性脑损害，由于神经元对缺血缺氧非常敏感，可以引起神经元的凋亡，进而影响脑功能的恢复。本实验就小鼠短暂性脑缺血后神经元中细胞周期蛋白与细胞周期蛋白依赖蛋白激酶的表达规律进行研究，为临床研究脑缺血提供形态学依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物分组

选用健康雄性昆明小鼠，体重25-40 g。购自北京军事医学科学院实验动物中心(SCXK-(军)2012-008)，小鼠自行摄食饮水。实验动物随机分为假手术组和缺血再灌注组。缺血组分缺血40 min后再灌注 3 h，5 h，12 h，1 d，3 d，5 d 共 6 组，每组 8只，假手术组每组各5只，共78只。

1.2 动物模型的建立及筛选

参照Longa等［1］的方法，建立小鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)缺血模型。具体步骤如下:①10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉，8% 硫化钠脱毛、备皮，消毒颈部皮肤。②沿颈正中线做一长度约1.5 cm的切口，分离下颌下腺，逐层分离深筋膜、肌膜及右侧胸锁乳突肌，仔细分离出右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，5-0丝线结扎颈外动脉。③在颈总动脉近端，颈内动脉处预置5-0丝线备用，并用止血钳牵拉。在颈总动脉距分叉部约1-2mm处剪一“V”形小口，缓慢插入线栓(直径为0.15 mm尼龙线用多聚赖氨酸包被，制备成长度为2 cm、头端烧灼为约0.20 mm钝头的线段)，直到遇到阻力为止，插入深度以颈总动脉分叉处算起，应插入8-9 mm;插线成功后，结扎颈总动脉以止血，结扎颈内动脉以固定尼龙线。消毒并缝合切口。以上手术操作在4×手术放大镜下进行。手术过程中小鼠的肛温维持在(37±0.5)℃。手术结束，将小鼠改为侧卧位，37℃下1 h，注意观察其生命体征变化。缺血再灌注组，缺血40 min后，拔出尼龙线5 mm进行再灌注，根据所需的再灌注时段取脑。假手术组的手术步骤相同，但插线深度不足6 mm。

小鼠脑缺血后表现出相应的症状和体征，这些症状与体征既可反映脑损伤与恢复的程度，也可作为模型制作是否成功的指标。参照Zea Longa评分法［1］，于小鼠清醒后进行评分，分0-4分五级。0分:无神经系统损害症状;1分:不能完全伸直左前爪;2分:向左侧转圈;3分:行走时向左侧倾斜;4分:不能自发行走。评分在2-3分的小鼠用于本实验。

1.3 取材与染色

选用缺血40 min再灌注1 d的脑组织迅速断头取脑，去除嗅球，从额极开始依次在脑前极与视交叉连线中点处、视交叉处、漏斗柄处、漏斗柄与后叶尾极之间，切成约1 mm厚的脑片。在1.5%红四氮唑(TTC)溶液中37℃孵育30 min，将其置入4%多聚甲醛保存、照相。

1.4 冰冻切片的制作及免疫荧光双重染色

脑组织固定后，依次浸入20%、30%蔗糖溶液中至沉底。从视交叉至脑桥前缘冠状位切取脑组织，OCT包埋，-20℃冷冻。用冷冻切片机行20 μm连续冠状切片，贴附于铬明胶处理过的载玻片上。室温干燥1 h，-20℃ 保存，待用。冰冻切片在室温下干燥1 h，0.5%Triton X-100室温10 min，0.01 mol/L PBS摇洗 3次，每次 5 min。用10%的正常山羊血清和兔血清在室温下孵育45 min，同时滴加两种不同来源的一抗(兔抗鼠NSE 1∶200/鼠抗兔 cyclin D1 1∶200，鼠抗兔 NSE 1∶200/兔抗鼠CDK4 1∶200)在湿盒中4℃ 孵育，过夜。第2天室温复温1 h，0.01 mol/L PBS摇洗3次，每次5 min，在暗环境下滴加异硫氰酸荧光素(FITC)和四乙基若丹明硫氰酸盐(TRITC)标记的与一抗相对应的荧光二抗(1∶50)，在室温孵育45 min，用0.05%TritonX-100避光摇洗，在观察NSE/cyclinD1时，滴加0.001%DAPI对比染色，50%甘油封片，在荧光显微镜下观察，用激发光为490-495 nm的蓝光，550 nm的绿光和紫外光观察。

2 结果

2.1 TTC染色

小鼠脑冠状切面右侧可见较大的苍白梗死区，与正常的脑组织(呈红色)界限较明显，说明动物模型成功(见图1)。

图1 小鼠脑缺血1 dTTC染色连续切片Figure 1 TTC staining of mice after ischemia for 1 d

图2 小鼠脑缺血1 d和3 d NSE和cyclin D1的免疫荧光双重染色 (×400)Figure 2 Double immunofluorescent staining of NSE and cyclin D1 after reperfusion for 1 d and 3 d in penumbra

图3 小鼠脑缺血1 d和3 dNSE和CDK的免疫荧光双重染色 (×400)Figure 3 Double immunofluorescence staining of NSE and CDK with reperfusion for 1 d and 3 d in penumbra (×400)

2.2 免疫荧光双重染色

缺血再灌注3 h、5 h和12 h组NSE在缺血中心区和半暗带分布，胞质着色，cyclin D1在半暗带和皮质少量表达，有的在胞质，有的在胞核表达，荧光强度较弱，在半暗带和缺血区有NSE与cyclin D1共同表达(图2，见第749页);缺血再灌注1 d，cyclin D1表达数量明显增多(95±2.43)，与3 d组(43±1.72)、5 d组(24±3.42)比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。NSE主要分布在半暗带，缺血中心区的NSE表达减少，主要在半暗带表达，细胞形态有的比较完整，可见明显的突起，有的为不规则形，缺血中心区内cyclin D1的表达也增加，细胞较小，可见绿色荧光强度强。缺血再灌注3 d，NSE和cyclin D1表达(图2D、H，见第749页)数量和强度都较1 d组下降，在半暗带cyclin D1在NSE阳性细胞中表达的数量减少，缺血中心区散在可见NSE和cyclin D1共同表达。

NSE用 TRITC标记，为红色荧光，CDK4用FITC标记，为绿色荧光。缺血再灌注3 h、5 h和12 h组NSE胞质着色，在缺血区和半暗带均有分布，CDK4在半暗带和皮质少量表达，有的在胞质，有的在胞核表达，荧光强度较弱，半暗带和缺血中心区有NSE与CDK4共同表达(图3，见第750页);缺血再灌注1 d，NSE主要分布在半暗带，缺血区的NSE表达减少，CDK4表达明显增多，主要分布在半暗带，细胞形态有的比较完整，有的为不规则形或圆形，缺血中心区内CDK4的表达也增加，细胞较小，半暗带可见NSE与CDK4共同表达的细胞数量增多，在缺血中心区内散在可见CDK4在NSE阳性细胞中表达;缺血再灌注3 d，NSE在缺血区内的数量继续减少，CDK4表达数量和强度都达高峰(124±2.36)，与1 d(56±1.57)、5 d组(24±3.46)比较，差异具有显著性(P＜0.05).在半暗带CDK4在NSE阳性细胞中表达的数量较1 d组减少;缺血再灌注5 d组，NSE在半暗带表达为主，缺血区散在，CDK4的表达减少，在半暗带周边可见少量CDK4在NSE阳性细胞中表达。

3 讨论

细胞周期是指连续的分裂细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束，细胞由一个分裂为两个子细胞所经历的整个过程。细胞周期的运行沿着G1期→S期→G2期→M期的顺序进行。细胞周期的调控可分为外源性和内源性调控，外源性调控主要是由外界刺激引起的。而内源性调控主要是通过cyclins、CDKs、细胞周期蛋白激酶抑制因子(cyclinkinase inhibitor，CKI)进行网络调控来实现［2］。在此过程中，cyclins激活相对应的CDKs，两者瞬时结合成特定的cyclins-CDKs复合物。此复合进而激活并启动下游蛋白因子，从而在细胞周期的各个阶段发挥相应的调节作用。CKIs在CDKs活化、cyclins/CDKs复合物形成以及该复合物激活下游因子的过程中，通过抑制CDKs来发挥其重要的调节作用。在G1/S期发挥主要作用的是cyclin D，其与CDK4或CDK6结合形成复合物而发挥作用，在G1期进入S期过程中起重要调节作用。

一般认为成熟的神经元是终末分化细胞，没有增殖能力，可以长期处于G0期。在正常神经元中cyclin D1和CDK4含量很少，大部分在胞质表达。近些年来研究发现，当神经系统受到损伤时，细胞周期相关蛋白在神经元中表达增多。

细胞的增殖、分化、死亡都是被细胞周期相关蛋白和它们之间的相互调节而精确地控制着，一旦这种调节被打破，周期相关蛋白可能会启动信号转导途径而导致细胞的死亡。体外实验，cyclin D1已经被认为是凋亡的标记:体外培养成年大鼠的交感神经细胞，在撤除NGF后cyclin D1表达可诱导凋亡［3］。用顺铂处理背根神经节细胞后，在凋亡的神经元中表达 cyclin D1［4］。但在体内实验中，关于cyclin D1和CDK4对缺血后神经元的作用看法不一。有人认为脑缺血后细胞周期相关蛋白的表达以其在凋亡机制中的作用为主，而不是在细胞周期中的作用，部分凋亡是由于细胞周期的异常调控所致［5］。

有研究［6，7］发现在大鼠缺血再灌注模型中，G1/S期相对应的cyclin D1和CDK4上调，可能对于缺血再灌注引起的脑损伤导致神经元的凋亡有重要的作用。Li等［7］认为在大鼠缺血2 h的局灶性脑缺血模型中，cyclin D1和CDK4在神经元和少突胶质细胞中表达，凋亡的细胞不表达cyclin D1和CDK4。说明细胞周期蛋白对于神经元的细胞分裂可能没有作用，但可能对于细胞的存活有作用。不可再生的神经元表达cyclin D1和CDK4可能对于修复DNA有作用，而不是使细胞重新进入细胞周期或凋亡。国外学者［8-10］发现，在全脑缺血模型中当神经元损伤时，微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein-2，MAP-2)和cyclin D1的表达都下调。二者在没有神经元损伤的区域包括CA3区和齿状回的表达都没有变化，cyclin D1对神经元的存活和凋亡都没有作用，但对于非神经元可能有。

本实验用荧光双重染色观察小鼠局灶性脑缺血后，cyclin D1在神经元中的表达1 d达高峰，以后表达逐渐下调。CDK4在神经元中的表达1 d天后增加，3 d天达高峰，5 d后下调，且两者主要在半暗带的神经元中表达。结果提示缺血导致细胞周期相关蛋白在成体的神经元中表达，如果神经元损伤程度低于死亡的阈值时，cyclin D1与CDK4结合形成的复合物可能会诱导修复损伤的DNA，但如果神经元缺血时间较长，DNA难以修复，就会引起神经细胞不可逆的调亡。

［1］ Longa Z，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20:84-91.

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［5］ Timsit S，Rivera S，Ouaghi P，et al.Increased cyclin D1 in vulnerable neurons in the hippocampus after ischaemia and epilepsy:a modulator of in vivo programmed cell death［J］.Eur J Neurosci，1999，11(1):263-269.

［6］ Wen Yi，Yang Shaohua，Liu Ran，et al.Cell-cycle regulators are involved in transient cerebral ischemia induced neuronal apoptosis in female rats［J］.FEBS Lett，2005，579:4591-4599.

［7］ Li Y，Chopp M，Powers C，et al.Immunoreactivity of cyclin D1/Cdk4 in neurons and oligodendrocytes after focal cerebral ischemia in rat［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1997，17(8):846-856.

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