P-JNK在A2AR敲除新生小鼠HIBD细胞凋亡中的表达研究*

范海玲，尹水贵，娄 普，任素伟，黄 胜，陈 翔

（1.温州医学院，2.温州医学院附属第二医院育英儿童医院，浙江温州325027）

新生儿缺氧缺血性脑损伤（hypoxia／ischemia brain damage，HIBD）是新生儿期危害最大的常见病，病死率高，且常遗留下脑瘫，后者以中枢性运动障碍为特征，常伴随有认知功能障碍等神经功能缺陷，其在国内外均有一定发病率且有增高趋势，因其发病机理复杂，临床治疗棘手，因此寻找阻止脑损伤进程，增强脑组织修复的治疗策略对HIBD患儿具有重要的临床意义。腺苷是一种内源性神经保护剂，近年来有关腺苷和腺苷受体A2A（adenosine A2Areceptor，A2AR）在成年鼠缺血性脑损伤中有神经保护作用，研究发现A2AR拮抗剂可以对抗成年鼠缺血性脑损伤引起的神经元凋亡［1］，Li Wei等［2］发现敲除A2AR可以减少急性脑外伤受损引起的神经元凋亡，因此A2AR可能在控制各种脑损伤引起的神经元凋亡方面起着重要的作用，然而相关的机制目前还不明确。c-jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信号通路是丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信号转导通路的其中一条，与细胞凋亡密切相关［3］。然而在A2AR敲除新生小鼠HIBD模型中有关神经细胞凋亡机制的研究尚未见报道。因此本实验通过建立7日龄新生小鼠HIBD模型，模拟围生期缺氧缺血性脑损伤的病理改变，进一步动态观察HIBD后各时间点小鼠的神经行为学和脑组织细胞形态学改变、神经细胞凋亡以及P-JNK表达的变化，研究敲除A2AR对HIBD模型小鼠脑组织神经细胞凋亡的影响并初步探讨其可能的作用机制，为腺苷早期用于该类疾病引起的脑功能损害提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（美国Roche公司），P-JNK兔单克隆抗体（CST公司），DAB显色试剂盒（美国ZYMED公司），RSS-51W型氧气监测仪CYES-II（德国LEICA公司），体式显微镜 ST60（宁波舜宇仪器有限公司），BX51光学显微镜（日本Olympus公司），Image ProPlus 6.0彩色医学图像分析系（美国Media Cybernetics公司）等。

1.2 实验动物及其分组

由美国波士顿大学医学院分子神经药理学研究所引进A2AR敲除杂合子小鼠，在温州医学院实验动物中心SPF级对引进的杂合子小鼠进行繁殖，根据基因型鉴定结果筛选A2AR敲除型（adenosine A2Areceptor knockout，A2ARKO）和 A2AR野生型（adenosine A2Areceptor wildtype，A2ARWT）小鼠供本实验使用。新生小鼠7日龄，雌雄不限，共80只。分组如下：敲除型假手术组（sham knockout，SKO）与野生型假手术组（sham wildtype，SWT），敲除型模型组（model knockout，MKO）与野生型模型组（modelwildtype，MWT），模型组分1 d，3 d，7 d，共8小组。新生小鼠入选标准：体重（3±0.5）g，平面翻正反射成绩高于正常值（2 s）两倍或两倍以上的小鼠要剔除。

1.3 新生小鼠HIBD模型的建立

参照经典Rice-Vannucci法建立7日龄新生小鼠HIBD模型［4］。将小鼠仰卧固定于手术板上，4%水合氯醛腹腔内麻醉后，在解剖显微镜下行颈部正中切口，分离出左侧颈总动脉，并用5-0号灭菌丝线远近端双线结扎，缝合伤口。整个手术过程在10 min内完成。恢复2 h后将小鼠置于37℃的恒温密闭缺氧瓶内，并输入8%氧气和92%氮气的混合气体，缺氧1 h；缺氧结束后，将存活的小鼠返回母鼠身边继续哺乳喂养。假手术组：仅游离左颈总动脉但不结扎且无缺氧处理。

1.4 指标检测

1.4.1 短期神经功能评定 实验动物造模后1 d，检测三种新生小鼠特殊的发育反射［5］：（1）翻正反射（righting reflex）：从小鼠仰卧位置开始计时，到小鼠自行翻身成俯卧位、前后爪放平计时停止；（2）趋地反射（geotaxis reflex）：将小鼠头朝下置于倾斜度为40°斜坡上，记录小鼠扭转身体（90°）头朝上所用的时间；（3）悬崖逃避反射（cliff aversion reflex）：将小鼠前爪悬于桌面边缘之外，桌面离地1 m，记录小鼠扭转身体（90°）离开桌面边缘所用的时间，若（2）和（3）项反射在20 s内不能完成，则剔除。另一方面，观察模型组小鼠是否出现向右转圈，若无，则剔除。

1.4.2 脑组织病理学检测 到达规定时间点后，4%多聚甲醛经心内灌注固定脑组织，随后切取含海马的大脑组织块置于4%多聚甲醛液中4℃固定24 h。常规脱水，石蜡包埋。选取海马齿状回互相环抱平面连续冠状切片，切片厚3～4μm，每隔5张取1张切片，每只小鼠取2张切片分别做HE染色和尼氏染色，在光镜下观察。

1.4.3 神经细胞凋亡检测 每只小鼠取1张石蜡切片用TUNEL染色，按说明书进行操作，DAB显色，含棕褐色和棕黄色颗粒细胞为阳性（凋亡）细胞。每张切片用Olympus-BX51显微镜及图像采集系统采集缺血侧海马CA1区（×400倍）光镜下5个不重叠视野，应用美国IPP 6.0图像分析软件对凋亡细胞阳性表达的区域测量累积光密度值（integrated optical density，IOD）。

1.4.4 SP法免疫组化检测缺血侧海马 CA1区 PJNK阳性细胞的表达 简要步骤如下：每只小鼠随机选5张切片脱蜡，3%H2O2于37℃15～20 min灭活内源性酶，PBS洗5 min×3次；微波修复抗原 10 min，降至室温，PBS洗 5 min×3次；滴加 P-JNK（1∶100）单抗单抗工作液，4℃孵育过夜，复温 45 min，PBS洗5min×3次；滴加山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体二抗，37℃孵育30 min，PBS洗5 min×3次，经DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封片，用PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：缺血侧海马CA1区P-JNK阳性表达细胞为胞浆、胞核均可呈现棕黄色。每只动物随机取免疫组化切片3张，Olympus-BX51显微镜及图像采集系统采集每张切片缺血侧海马 CA1区（×400倍）光镜下5个不重叠视野，用美国IPP 6.0图像分析软件测量累积光密度值（integrated optical density，IOD），再计算其平均光密度值（IOD／area），即 P-JNK阳性细胞表达的相对含量。

1.5 统计学处理

所有数据以均值 ±标准差（±s）表示，应用SPSS 16.0对数据进行统计分析并进行正态性检验。两组间比较采用t检验，多组间比较用单因素方差（one-way ANOVA）分析，两两比较用 LSD-t检验，方差不齐的用 Dunnett’T3检验，两变量的相关性采用Pearson线性相关分析。

2 结果

2.1 新生小鼠HIBD模型的评估

2.1.1 新生小鼠HIBD神经行为学的改变 （1）造模过程中小鼠的行为学改变：缺氧约10 min，动物开始烦躁不安，缺氧15～20 min，出现呼吸加深加快，口唇发绀；约30 min大部分站立不稳，偶有激惹现象；40～50min大部分小鼠活动明显减少，平面翻正反射时间超过10 s，肤色苍白发绀明显；1 h时几乎所有小鼠出现翻身不能、嗜睡。（2）短期神经功能评定：实验动物造模后1 d，模型组约80%的小鼠出现向右转圈，与基因型无关。通过检测三种新生小鼠特殊的发育反射，结果表明S组小鼠均未出现明显的神经功能缺损症状，M组小鼠完成翻正反射、趋地反射和悬崖逃避反射的时间明显长于S组（P＜0.01），均出现不同程度的神经功能缺损症状，并且M1dKO组完成上述反射的时间均长于M1dWT组（P＜0.01、P＜0.05），各组差异有统计学意义（表 1）。

Tab.1 Effect of adenosine A2A receptor knockout（A2ARKO）on righting reflex and geotaxis reflex and cliff aversion reflex followed 1 day of newbornmice after hypoxia／ischemia brain damage（s，±s）

Tab.1 Effect of adenosine A2A receptor knockout（A2ARKO）on righting reflex and geotaxis reflex and cliff aversion reflex followed 1 day of newbornmice after hypoxia／ischemia brain damage（s，±s）

S：Sham；WT：Wildtype；KO：Knockout；M：Model*P＜0.05，**P＜0.01 vs Sham group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs WT group

Group n Righting reflex Geotaxis reflex Cliff aversion reflex SWT 10 2.9000±0.7379 7.6000±0.7888 10.8000±1.1236 SKO 10 3.2000±0.6325 7.3000±0.2134 11.0000±1.0541 M1dWT 30 3.9667±0.5561** 13.6333±0.9353** 15.3667±0.8899**M1dKO 30 5.2000±0.6644**＃＃ 15.7667±0.3781**＃＃ 15.9667±1.3515**＃

2.1.2 新生小鼠HIBD脑组织细胞形态学变化即脑组织病理光镜结果 （1）HE染色结果：S组大脑海马CA1区细胞排列整齐，细胞间质均匀，细胞结构正常，未见神经细胞变性坏死等明显病理变化。M组缺血侧海马CA1区结构模糊，组织间隙明显增宽，细胞和间质水肿较严重，出现明显空泡化；M1d组损伤最明显。与MWT组比较，MKO组各时间点病理损伤均有不同程度的加重（图1）。（2）尼氏染色结果：S组大脑海马CA1区结构清晰，细胞形态正常，排列整齐，尼氏小体呈深蓝色斑块状，分布量多。M组缺血侧海马CA1区结构模糊，细胞数减少，排列稀疏，细胞肿胀，甚至尼氏小体出现溶解、空泡化，尼氏小体大量脱失；M1d组损伤最明显。与MWT组比较，MKO组各时间点细胞的肿胀及空泡化较明显，尼氏小体的丢失量更多（图2）。

2.1.3 TUNEL染色检测凋亡神经细胞结果 S组脑组织海马CA1区有少许的凋亡细胞，而SKO组和SWT组无显著性差异（P＞0.05）。与 S组比较，M组缺血侧海马CA1区各时间点凋亡细胞均明显增加，差异显著（P＜0.01）。M1d神经细胞凋亡表达至高峰，随后逐渐下降，MKO组和MWT组有相似的表达规律。与MWT组比较，MKO组神经凋亡细胞表达的较多，各组差异显著（P＜0.01，图 3）。

Fig.1 Hematoxylin-Eosin staining in ischemic hippocampus CA1 domain of newbornmice（×400）

Fig.2 Nissl’s staining in ischemic hippocampus CA1 domain of newbornmice（×400）

Fig.3 Expression ofnerve cellapoptosis in ischemic hippocampus CA1 domain of newbornmice.Brown staining represents positive expression in nuclei（TUNELDAB×400）

2.2 新生小鼠HIBD后脑组织P-JNK阳性细胞表达的免疫组化检测结果

S组脑组织海马CA1区有散在的P-JNK阳性细胞表达，而 SKO组和 SWT组无显著性差异（P＞0.05）。与S组比较，M组缺血侧海马 CA1区各时间点P-JNK阳性细胞表达均明显增加，差异显著（P＜0.01）；M1d达高峰，随后逐渐下降；与 MWT组比较，MKO组有较多的P-JNK阳性细胞表达，以1 d为著（P＜0.01），随着时间的延长，P-JNK的阳性细胞越来越少，3 d时（P＜0.05），7 d时（P＞0.05，图 4）。0.01vsWT group

Fig.4 Expression of P-JNK in ischemic hippocampus CA1 domain ofnewbornmice.Brown staining represents positive expression in cytoplasm and nuclei（Immunohistochemistry DAB×400）

2.3 直线相关性分析

大脑海马CA1区的神经细胞凋亡表达与P-JNK的阳性细胞表达呈显著正相关（r＝0.837，P＜0.01，图 5）。

Fig.5 Correlation analysis between expression of P-JNK and expression of nerve cell apoptosis in ischemic hippocampus CA1 of newbornmice（r＝0.837，P＜0.01）

3 讨论

围生期（妊娠28周到生后4周）脑损伤是导致儿童脑性瘫痪，残疾，精神发育迟滞、学习困难和癫痫等神经功能障碍性疾病最主要的原因。例如，缺血、缺氧、黄疸、早产、出血、感染等均是围生期主要致脑损害的危险因素。生后7日龄的小鼠脑发育程度类似足月儿，缺氧的时间长短与脑损伤程度有关，且重度脑损伤不利于脑保护作用的研究，故本实验采用的是脑缺血后缺氧1 h所导致的轻中度脑损伤，使用7日龄A2ARKO和A2ARWT小鼠制作HIBD模型进行脑损伤发病机制的研究，初步探讨敲除A2AR对新生小鼠HIBD所致神经细胞凋亡的影响及可能的作用机制。新生鼠HIBD是整个脑组织经历缺血-缺氧-再灌注的病理生理过程，HIBD模型制作成功的指标有：神经行为异常、显微镜下脑组织病理形态学改变、神经细胞大量凋亡等，本实验对这些指标进行检测，结果表明：M组出现明显的神经行为异常；缺血侧脑组织海马CA1区在光镜下显示M组有明显的缺血性病理改变，神经细胞变性坏死甚至发生空泡化，尤以1 d组最明显；同时发现M组神经细胞凋亡较S组显著增加。这些结果表明本实验成功建立新生小鼠HIBD模型。随着时间的推移，病理变化均逐渐减轻，这一现象表明缺血性脑损伤再灌注期病理变化的减轻可能与神经细胞的自身修复有关。

腺苷是中枢神经系统普遍存在的一种神经递质，各种脑损伤时，由于代谢负荷加重和组织反应能力下降导致胞外腺苷浓度迅速上升，进而产生一系列病理生理效应。A2AR在海马、皮层、纹状体等处均有表达，但海马是缺血敏感区域，且与认知密切相关，故本实验选取A2AR敲除新生小鼠HIBD后缺血侧海马进行神经细胞凋亡机制的研究。有关新生大鼠G蛋白偶联的A2AR研究发现出生时CGS 21680的结合位点是成年鼠的3，5日龄是成年鼠的15.5，15日龄是成年鼠的1／3，25日龄是成年鼠的75，CGS 21680的结合位点从出生后到成年逐渐增多，所以此结合位点越少，A2AR的亲和力越高，推测早期的A2AR在脑发育过程中起重要作用［6］。Bona等［7］对7日龄大鼠进行HIBD后给予非选择性腺苷受体拮抗剂茶碱，A1R拮抗剂（DPCPX），A2AR拮抗剂SCH58261，14 d后发现茶碱和SCH58261有保护缺氧缺血性脑损伤的作用。腺苷作为一种内源性神经保护剂，我们的实验表明，在7日龄新生小鼠 HIBD后，与野生型小鼠相比较，敲除A2AR加重近期行为学障碍、脑组织病理损伤以及神经细胞凋亡，且结果与 Adén U［8］的研究结果一致，却与 Bona等［7］的结果相矛盾，推测可能与以下因素有关：（1）受体的数量：新生鼠A2AR的数量较成年鼠少；（2）受体的功能：在新生鼠HIBD后使用抑制剂时尚有部分受体存在并且发挥作用。研究发现A2AR在成年鼠缺血性脑损伤中与新生鼠HIBD中的作用不同，推测可能是未成熟脑组织缺血性脑损伤的病理生理机制不同所造成。

c-jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）促进细胞凋亡的机制有二：一是JNK使转录因子的活性增强，促进 P53、Bax、FasL、TNF等促凋亡蛋白表达；二是作用于线粒体的Bax途径。JNK通路的激活与细胞凋亡关系密切，可介导氧化应激、细胞因子、紫外线、蛋白质合成抑制剂、渗透压应激等。缺血／再灌注模型中发现特异性腺苷A2AR拮抗剂SCH 58261可通过抑制MAPK通路的表达起到神经保护作用［17］，而且该神经保护与抑制缺血／再灌注后少突胶质细胞JNK／MAPK通路的活化有关，与小胶质细胞 ERK1／2通路活化无关［2］，A2AR还在控制各种缺血性脑损伤引起的神经元凋亡方面起着重要的作用［9、10］。这些结果表明 A2AR在控制缺血性脑损伤引起的神经元凋亡过程中可能与MAPK密切有关。在实验过程中，我们观察到M组海马CA1区PJNK阳性细胞的表达较S组明显增多（P＜0.01）；与MWT组比较，MKO组P-JNK阳性细胞表达明显增多，以1 d组最明显，且 P-JNK只在新生小鼠HIBD后的早期高表达；神经凋亡细胞与P-JNK阳性细胞的表达呈显著正相关，但高表达持续的时间比PJNK要长。因此敲除A2AR增加新生小鼠HIBD导致的神经细胞凋亡及加重脑损害的过程，可能与早期P-JNK的高表达有关，提示敲除A2AR可能通过促进早期P-JNK的持续激活而加重HIBD的神经细胞凋亡，推测可能存在其他可能的凋亡机制。

由以上结果我们可以得出结论，早期P-JNK的持续激活可能参与A2AR敲除增加新生小鼠HIBD的神经细胞凋亡及加重脑损害的过程。本实验首次对腺苷敲基因新生小鼠HIBD的凋亡机制进行研究，为腺苷早期用于该类疾病引起的脑功能损害提供实验依据。然而要真正阐明A2AR与神经凋亡细胞之间的关系还有待于进一步实验研究。

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