槲皮素对兔离体肠平滑肌的舒张作用及其机制*

张 佳，邵正威，高 雅，王巧云

（1.滨州医学院口腔学院，2.滨州医学院基础学院，山东 烟台264000）

槲皮素（quercetin，3，3’，4’，5，7-pentahydroxyflavone）是一种多羟基黄酮类化合物，化学名为3，3’，4’，5，7—五羟基黄酮，广泛存在于植物的花、叶、果实中，如菊花、绞股蓝、山碴、银杏叶等，具有抗氧化及清除自由基、抗纤维化、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、降糖、降压、心血管保护、免疫调节、镇痛及止泻等广泛药理作用［1-3］。近年研究表明，槲皮素能够抑制正常小鼠胃排空及小肠推进［4-5］，但其作用机制尚不明确。本实验通过离体家兔小肠平滑肌灌流方法，进一步探讨不同浓度槲皮素对离体肠平滑肌收缩活动的影响及其作用机制，以期为槲皮素在消化系统疾病治疗方面的研发和应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

槲皮素（南京泽朗医药科技有限公司，纯度为98%，批号ZL20091211），实验时将槲皮素用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配成药液备用。钌红（ruthenium red，RR）、Bay K8644、肝素（heparin，HP）和左旋硝基精氨酸甲酯（nitro-L-argininemethylester，L-NAME）均购自 Sigma公司；氯化乙酰胆碱（acetylcholine chloride，Ach，批号 091201，中科院上海生物化学研究所试剂厂）。磷酸组胺（histamine phosphate，中国科学院上海生物化学研究所）。氯化钡（BaCl2，自贡市张家坝盐华有限公司）。实验用Tyrode’s液（台式液，g／L）：NaCl 8.0，CaCl20.2，KCl 0.2，MgCl20.1，NaHCO31.0，KH2PO40.05，葡萄糖1.0。无钙 Tyrode’s液以 EDTA代替 CaCl2外，其余成分相同。家兔 （2.5±0.4）kg，雌雄兼用（由滨州医学院动物中心提供）。BL-420F生物信号处理系统（成都泰盟科技有限公司），JH-2型肌张力传感器（中国北京航天医学工程研究所产品）。

1.2 家兔离体小肠平滑肌标本的制备

取健康家兔，禁食24 h后，用木槌猛击兔头枕部致死。迅速沿腹正中线切开腹部，取近回盲部小肠20 cm。置于盛有室温Tyrode’s液的烧杯中，洗净肠内容物。将其剪成2～3 cm的肠段作为实验标本。

1.3 收缩活动的记录方法

将标本的一端固定于L形钩上，置于盛有20 ml Tyrode’s液的平滑肌槽中；另一端连接张力换能器，持续通混合气体（0.95O2＋0.05CO2，每秒 1～2个气泡），温度（37±0.5）℃ ，张力负荷2 g，平衡1 h，待系统稳定后，开始实验。

1.4 槲皮素对小肠平滑肌自主收缩活动的影响

待回肠收缩曲线稳定后，累计加入槲皮素，使终浓度分别达 20、40、60、80、100μmol／L，加药间隔时间为5min，观察槲皮素对家兔小肠平滑肌自发收缩活动的影响。用区间测量法测量给药前1 min及给药后第5分钟的张力，以给药前的值为100%，按公式计算给药后小肠舒张百分率［6］。

1.5 槲皮素对乙酰胆碱、氯化钡及组胺所致肠痉挛性收缩的影响

待回肠收缩曲线稳定后，首先给予乙酰胆碱（0.1μmol／L）、氯化钡（10mg／L）或组胺（5mg／L），当刺激平滑肌收缩达平台后，再累计加入槲皮素（终浓度同上），观察其对乙酰胆碱、氯化钡或组胺刺激所致痉挛性收缩肠平滑肌是否具有舒张作用。

1.6 槲皮素对BayK8644作用的影响

观察槲皮素100μmol／L预孵育10min后对Bay K8644（0.5μmol／L）致小肠平滑肌自发收缩活动的影响。对照组采用相等容积的DMSO。

1.7 RR、HP或L-NAME预处理对槲皮素肠舒张肠平滑肌的影响

肠平滑肌标本稳定后，分别加入ryanodin受体阻断剂 RR（10μmol／L）、三磷酸肌醇（trisphosphate inositol，IP3）受体阻断剂 HP（50 mg／L）和 L-NAME（100 μmol／L）共孵育 15 min后，立即加入终浓度为 100 μmol／L的槲皮素。

1.8 统计学处理

实验数据以均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 13.0统计分析软件进行统计学分析，组间差异比较采用单因素方差分析中的LSD方法。

2 结果

2.1 槲皮素对家兔离体肠平滑肌收缩活动的影响

20～100μmol／L槲皮素能够剂量依赖性抑制小肠平滑肌自发收缩，使舒张作用增强。对组胺、乙酰胆碱以及氯化钡所致肠平滑肌痉挛性收缩亦均有一定的抑制作用，但强度不同。槲皮素浓度为100 μmol／L时，对组胺痉挛性收缩的抑制百分率为83.68%；乙酰胆碱次之，抑制百分率为 78.68%；而对氯化钡引起痉挛性收缩抑制百分率为74.42%；但对肠平滑肌自发收缩活动抑制作用较弱，仅为58.92%（表 1，图 1）。

Fig.1 Effect of quercetin on spontaneous contractive activity of rabbit small intestine smoothmuscle

Tab.1 Effectof quercetin on the contraction of small intestine smoothmuscle of rabbits in vitro（±s，n＝8）

Tab.1 Effectof quercetin on the contraction of small intestine smoothmuscle of rabbits in vitro（±s，n＝8）

Que：Quercetin*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Group Rate of relaxition（%）Que 20μmol／L Que 40μmol／L Que 60μmol／L Que 80μmol／L Que 100μmol／L Control 31.52±6.65 37.11±7.52 39.59±5.76 58.93±7.81 58.92±6.20 Histamine（5mg／L） 66.65±10.36** 71.52±9.16** 76.45±8.51** 79.69±7.85** 83.68±5.54**Acetylcholine（0.1μmol／L）35.58±5.92 55.20±6.68* 68.08±8.60* 73.63±8.28* 78.68±8.55**Bacl2（10mg／L） 32.27±7.51 44.15±8.83 59.24±7.57* 68.61±4.87* 74.42±3.32**

2.2 槲皮素对Bay K8644作用的影响

Bay K8644是 L型 Ca2＋通道开放剂，Bay K8644（0.5μmol／L）使小肠平滑肌自发收缩张力由（1.03±0.03）g增加到（1.27±0.09）g（P＜0.01）；而槲皮素（60μmol／L）预处理后再加入 Bay K8644（0.5μmol／L）收缩张力降为（0.69±0.03）g（P＜0.01，图 2）。

Fig.2 Influences of quercetin（60μmol／L）on the Bay K8644（0.5μmol／L）induced changes on spontaneous contractile activity of rabbit small intestine smoothmuscle（n＝6～8）

2.3 RR、HP或L-NAME预处理对槲皮素舒张肠平滑肌的影响

与槲皮素组比较，肌浆网ryanodine受体阻断剂RR（10μmol／L）预孵育后对槲皮素舒张肠平滑肌作用无明显影响（P＞0.05）；而 IP3受体阻断剂 HP（50 mg／L）预孵育后可减弱槲皮素的舒张肠平滑肌作用，对肠平滑肌的舒张百分率由39.44%±5.19%减为 25.45%±3.42%（P＜0.05）。L-NAME预孵育使槲皮素舒张肠平滑肌作用由原减弱为29.76%±4.14%（P＜0.05，图 3）。

Fig.3 Influences of RR（10μmol／L）、HP（50 mg／L）and LNAME（100μmol／L）on the quercetin（60μmol／L）induced changes on spontaneous contractile activity of rabbit small intestine smoothmuscle（±s，n＝8）

3 讨论

胃肠平滑肌痉挛可引起腹痛、腹泻，是临床常见的疾病之一。目前研究认为胃肠道上主要存在M胆碱受体、组胺受体、5-HT受体及多种胃肠激素等受体。乙酰胆碱（Ach）是平滑肌内兴奋传递的化学物质能，激动M胆碱受体使胞内第二信使三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DG）浓度上升，进而引起Ca2＋释放和底物蛋白磷酸化激发平滑肌产生收缩效应。组胺（histamine，HA）是具有多种生理功能的胺类物质。能被传统抗组胺药所阻滞的豚鼠平滑肌上的组胺受体被称为H1型组胺受体（H1-R），HA作用于H1-R使钙通道开放，胞内游离Ca2＋浓度升高，促发胃肠道平滑肌收缩［7］。而BaCl2是通过释放细胞内的Ca2＋而引起肠管平滑肌痉挛［8］。本实验结果显示，槲皮素能剂量依赖性地抑制肠平滑肌的自发性收缩及乙酰胆碱、组胺或BaCl2引起痉挛性收缩，但对痉挛收缩肠平滑肌的作用明显强于自发性收缩肠平滑肌（P＜0.05或P＜0.01）。

因乙酰胆碱、组胺以及BaCl2引起肠管平滑肌痉挛性收缩，都与肠平滑肌细胞内Ca2＋增多有关。故推断槲皮素抑制肠平滑肌痉挛性收缩与降低细胞内Ca2＋浓度有关。肠道平滑肌收缩所需的大部分钙是在动作电位发生时从细胞外进入肌细胞内的，小部分来源于肌浆网，当胞内Ca2＋浓度升高到一定水平（1～50μmol／L）时，与肌钙蛋白或肌调蛋白结合，触发平滑肌收缩［9］。为此我们进一步研究了槲皮素对外钙内流和内钙释放的影响。

肠平滑肌中主要的钙通道是L型电压依赖性钙通道（L-Ca2＋），实验中给予小肠平滑肌L型钙通道的开放剂Bay K8644，大量的钙离子通过L型钙通道进入平滑肌细胞内，使其自发收缩力提高。而给予槲皮素后，这种效应被明显抑制（P＜0.01），由此可以推断槲皮素可能阻断L型钙通道，抑制Bay K8644引起的外钙内流，从而抑制小肠平滑肌的收缩。

细胞内Ca2＋的释放主要来自肌浆网。平滑肌细胞肌浆网内Ca2＋释放主要是通过IP3受体和ryanodine受体来完成。当这些受体被激活开放时，引起肌浆网内Ca2＋释放，从而导致细胞浆内Ca2＋浓度升高，肠平滑肌发生收缩。槲皮素的活性作用有可能通过抑制IP3途径和（或）ryanodine受体途径完成。为此，我们观察了HP及RR预处理下槲皮素对肠平滑肌的作用，以探讨这两条途径是否介导槲皮素的舒张平滑肌作用。预先应用肌浆网ryanodine受体阻断剂RR后，对槲皮素舒张肠平滑肌作用无明显影响（P＞0.05），而应用 IP3受体阻断剂HP则减弱槲皮素舒张作用，由此推断，IP3受体途径抑制引起内钙释放减少可能介导槲皮素舒张肠平滑肌作用，但其对肌浆网ryanodine受体途径引起内钙释放无明显影响。

有研究表明［10］，NO通过激活平滑肌细胞内的鸟苷酸环化酶，使胞质cGMP浓度升高，胞内Ca2＋降低，导致平滑肌舒张。本实验中应用NO合酶抑制剂L-NAME预孵育的条件下，槲皮素舒张肠平滑肌作用减弱（P＜0.05），说明槲皮素对小肠平滑肌的抑制作用亦可能与NO浓度有关，关于其对NO下游鸟苷酸环化酶有无影响尚待进一步研究。

实验结果提示，槲皮素抑制家兔离体小肠平滑肌收缩活动的机制可能为增加小肠平滑肌NO浓度，抑制外钙内流和IP3受体途径引起内钙释放，最终使细胞内钙离子浓度降低，平滑肌舒张而达到解除肠平滑肌痉挛。但槲皮素对肌浆网ryanodine受体途径引起内钙释放无明显影响。本实验研究为槲皮素用于肠痉挛性疾病治疗提供了实验依据。

［1］ 孙 涓，余世春.槲皮素的研究进展［J］.现代中药研究与实践，2011，25（3）：85-88.

［2］ Davis JM，Murphy E A，Carmichael M D.Effects of the dietary flavonoid quercetin upon performance and health［J］.Curr SportsMed Rep，2009，8（4）：206-213.

［3］ 王朝杰，杨 炼，廖小岗.槲皮素对肝肿瘤细胞生长周期的影响［J］.中国新药与临床杂志，2004，23（10）：695-698.

［4］ 黄伟锋，欧阳守，林燕飞，等.槲皮素对胃肠运动的影响及其机制［J］.世界华人消化杂志，2009，17（18）：1815-1819.

［5］ 任守忠，陈 峰，刘明生，等.肠胃康体内成分对急性胃肠炎作用的实验研究［J］.西北药学杂志，2010，25（4）：277-278.

［6］ 宋士军，李芳芳，张丽华，等.何首乌对家兔小肠平滑肌收缩活动和电活动的影响［J］.河北医科大学学报，2007，28：85-88.

［7］ Bolton T B，Clark JP.Effects of histamine，high potassium and carbachol on 42K efflux from longitudinal muscle of guinea-pig intestine［J］.JPhysiol，1981，320：347-361.

［8］ 韩 坚，陈孝健.离体肠管实验的研究概况［J］.中医药导报，2008，14（3）：94-97.

［9］ Bolton T B，Prestwich SA，Zholos A V，et al.Excitationcontraction coupling in gastrointestinal and other smoothmuscles［J］.Annu Rev Physiol，1999，61：85-115.

［10］李 茜，马会杰，关 王月，等.人参皂苷Rgl对家兔离体小肠平滑肌自发收缩活动的影响［J］.中国药理学通报，2009，25（10）：1350-1354.