鸟氨酸脱羧酶抗酶1基因的结构和功能

马 容 康 波 姜冬梅 何 珲

(四川农业大学动物科技学院，雅安 625014)

多胺是活细胞的必需成分。研究表明，细胞内缺乏多胺将抑制细胞生长，而多胺水平过高则会导致癌症发生［1］。因此，细胞内多胺水平的稳态对维持细胞的正常生命活动具有重要意义。鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase，ODC)是多胺合成代谢途径中的限速酶，催化鸟氨酸转变为腐胺，因此ODC在维持细胞多胺稳态的过程中起到重要作用。ODC的生物活性可在转录、翻译和翻译后水平被精确调控［2］。鸟氨酸脱羧酶抗酶1(ornithine decarboxylase antizyme 1，OAZ1)是多胺诱导的并能反馈调控多胺合成和跨膜转运的一种蛋白酶，可参与调控细胞内的多胺水平［3］。近年来研究发现，OAZ1还具有调控细胞周期、抑制肿瘤细胞增殖以及调控动物繁殖的功能。本文旨在就OAZ1基因结构和功能的研究进展作一综述，为进一步深入研究OAZ1功能及作用机理提供参考。

1 OAZ1基因结构

1.1 OAZ基因家族成员及基因结构

OAZ是由OAZ基因通过特殊的阅读框移码机制翻译的蛋白质。目前，已发现的OAZ基因家族成员有OAZ1、OAZ2、OAZ3和OAZ4，其中 OAZ1是调控ODC功能的重要成员，可介导ODC被26S蛋白酶体降解并能抑制多胺跨膜物质转运;OAZ2的结构和组织分布与OAZ1相似，但在各种组织中的表达水平较低，能抑制细胞摄入多胺，但不能促进ODC降解;OAZ3是精子特异性表达的抗酶基因，在整个精子发生过程中维持体内多胺的平衡，但不能调节ODC的降解［4］;OAZ4最初是从人脑cDNA文库中克隆获得的，但相关研究甚少，其结构和功能尚不十分清楚。总之，OAZ1、OAZ2、OAZ3和OAZ4虽被归为抗酶家族，但其组织定位、基因结构和功能都不尽相同。OAZ1基因是由5个外显子和4个内含子组成的，其核糖体框移位点存在于第2个外显子中。OAZ1 mRNA的转录起始位点位于第1个ATG密码子上游的第75和76位核苷酸，在起始位点上游存在特殊的启动子序列，包括1个TATA盒和2个CAAT盒。Hoffman等［5］应用核磁共振技术揭示了OAZ1氨基酸序列的二级结构，发现OAZ1在第87～227氨基酸区间含有8个β折叠和2个α螺旋，其中β折叠结构正向和反向平行混合组成β片层结构，为后继研究OAZ1蛋白不同区域的功能提供了很好的模型。目前作者已成功克隆了四川白鹅OAZ1基因的全长cDNA序列，其编码216个氨基酸残基，四川白鹅OAZ1基因序列与原鸡的相似性达98.3%，预测氨基酸序列与原鸡的相似性为97.0%。四川白鹅OAZ1预测的氨基酸序列中α螺旋结构占19.91%，β折叠结构占23.61%。

1.2 OAZ1的+1移码机制

OAZ1是最早发现的依靠翻译阅读框的转换来正确解码的哺乳动物基因。OAZ1的开放阅读框(open reading frame，ORF)由重叠的 ORF1和ORF2组成，ORF1含有起始密码子和终止密码子，编码非保守的多肽链;而ORF2只含有终止密码子，编码高度保守的多肽链。OAZ1 mRNA的翻译需要一个+1移码的过程。四川白鹅OAZ1基因的cDNA序列包含652 bp的完整编码区序列，其ORF1(由58个氨基酸组成)与ORF2(由158个氨基酸组成)间的+1移码位点位于第1个起始密码子ATG后的第175位碱基(TCCTGATG)。研究表明，多胺和部分多胺类似物能通过一个特殊的调控机制调节OAZ1全长功能蛋白的合成。当细胞内多胺水平较低时，核糖体解码至ORF1的5'端终止密码子TGA处终止翻译，合成无抗酶活性的多肽链。当细胞内多胺水平较高时，核糖体解码至ORF1的5'端终止密码子处，翻译框架+1移码，核糖体跃过 ORF1的终止密码子中的 T，以ORF2的指导进行翻译，合成由全部227个氨基酸残基组成的OAZ1全长功能性蛋白［6］。研究表明，OAZ1主要通过泛素化途径被26S蛋白酶体降解，而多胺可以通过诱导OAZ1 mRNA翻译中的+1移码机制来抑制这个泛素化降解过程，上调OAZ1的表达，从而使ODC降解，抑制多胺的生物合成过程［7］。因此，细胞内的多胺、ODC、OAZ1之间相互影响，相互拮抗，使细胞内的多胺水平得以维持稳定，从而保证细胞的正常生长。

2 OAZ1的功能

2.1 OAZ1负调控细胞内多胺的水平

多胺的水平过低可能使细胞生长减少甚至死亡，但是当其水平异常升高时也会导致癌症的发生，而且可以诱导细胞的凋亡［8］。因此，维持细胞内多胺水平的稳定对细胞的正常生长有着十分重要的意义。OAZ1能同时调节多胺的生物合成和多胺的摄取［9］，可以通过2条途径降低细胞内多胺的水平:第1条途径是通过对ODC的抑制。ODC是多胺合成代谢途径中的第一限速酶，而细胞内天然存在的OAZ1是ODC的非竞争性蛋白抑制因子［10－11］，在离体或在体条件下，均能抑制ODC活性，促使 ODC降解。Fraser等［12］研究表明，OAZ1低表达的细胞中ODC的活性显著增强，而且细胞内的腐胺水平显著增加，比一般细胞的水平高3倍，说明OAZ1缺乏主要影响细胞内腐胺的水平。Pietila等［13］将过表达 OAZ1的慢病毒用于细胞培养过程中，也能检测到细胞内ODC活性显著减弱。OAZ1对ODC的抑制作用并不是直接降解ODC，而是通过非泛素依赖性机制和泛素依赖性机制直接抑制ODC的催化活性。在非泛素依赖性机制中，OAZ1连接到ODC蛋白上，与之结合形成ODC-OAZ1复合物，运输至胞浆后被26S蛋白酶体降解［14］。ODC是一个二聚体酶，亚基间能迅速地结合和解聚，而OAZ1与ODC单体蛋白有极高的亲和力。OAZ1分子的C末端肽段(121～227氨基酸)与ODC亚基结合形成二元复合物，从而使ODC亚基C末端降解信号(425～461氨基酸)暴露出来，然后在OAZ1分子的N末端(70～120氨基酸)的作用下靶向ODC亚基以非泛素化形式被26S蛋白酶体降解，同时，OAZ1自身从复合体中释放，参与其他ODC亚基的降解。进一步研究表明，介导ODC亚基降解并不是加快了26S蛋白酶体降解ODC的速率，而是使26S蛋白酶体与ODC-OAZ1复合体的亲和力显著增强，OAZ1的存在能使ODC的降解速率显著提高，半衰期由原来的1 h变为10 min［15］。第2条途径是抑制细胞对多胺的摄取。OAZ1可通过调控细胞膜上的多胺转运体的表达来抑制细胞从外环境中摄取多胺，并促进胞内多胺的外排［16－17］。综上所述，OAZ1能通过多种方式负性调节细胞内的多胺水平，从而使细胞内多胺水平维持相对稳定。

2.2 OAZ1对细胞周期的调节

Cyclin D1是调控细胞周期G1期的关键蛋白质，能与多种细胞周期蛋白相互作用，对细胞周期的调控至关重要。以前的研究表明，OAZ1可通过介导Cyclin D1降解，抑制细胞周期。然而，Fraser等［12］通过抑制H157中OAZ1基因表达的研究表明，OAZ1在Cyclin D1调节的过程中并未发挥作用，认为Cyclin D1的减少可能是由于细胞的生长速率减慢所导致的。与Cyclin D1相似，Cyclin E1也是影响细胞从G1期向S期过渡的关键蛋白质。Pietila等［13］研究表明，长时间的 OAZ1诱导将使LNCaP细胞内的G0/G1期的细胞比例明显增加，并伴随着Cyclin E1的损耗。Alm等［18］研究表明，在细胞从G1期向S期过渡时多胺的生物合成达到顶峰，推测该过程可能受OAZ1的调控。刘梦瑶等［19］通过研究OAZ1高表达对小鼠黑素瘤细胞B16-F1细胞周期的影响表明，OAZ1高表达使G0/G1期细胞比例明显增加，而S期和G2期细胞比例明显减少，提示OAZ1可使B16-F1细胞生长阻滞于G0/G1期。另外，Lin等［20］研究表明，高表达的OAZ1可以使Smad1被蛋白酶体所降解。OAZ1通过降解Smad1，减弱转化生长因子－β(transformation growth factor-β，TGF-β)和 Wnt信号途径，可能是抑制细胞增殖的另一种方式［21］。因此，OAZ1可以通过降解各种生长因子来调节细胞的生长。

2.3 OAZ1 抗肿瘤效应

多胺是细胞生长的必需组分，在各种癌细胞中，多胺水平显著高于正常细胞。细胞的多胺水平与多胺生物合成、分解代谢和运输相关，合理地调节这些途径可以达到抗肿瘤治疗的效果［22］。多胺的生物合成速率受ODC活性的调节，在许多癌细胞中ODC的活性显著增强。在许多种类的细胞系(如恶性口腔角化细胞癌、肝细胞癌和前列腺癌)中发现OAZ1的高表达与肿瘤细胞周期阻滞于G1期的现象相一致，说明OAZ1具有抗肿瘤效应，起着肿瘤抑制因子的作用，在抗肿瘤治疗中具有潜在应用价值。研究表明，OAZ1能够降解与细胞生长相关的蛋白质，防止中心体异常，促进DNA双链的修复。Ishii等［23］研究表明，高水平的OAZ1能减少多胺水平和磷酸化激酶活性，从而使平滑肌细胞的培养出现较低的增生速率。在各种鼠模型中，OAZ1的高表达均能减少肿瘤的形成［24］。Boner等［25］通过酵母双杂交筛选，发现 OAZ1能与人类乳头瘤病16编码的HPV16 E2蛋白结合，介导该蛋白质经非泛素化途径降解，降低其活性和水平，从而影响宫颈癌细胞的生长和增殖。Aurora-A是中心体相关丝氨酸/苏氨酸致癌激酶，可通过对抑癌基因p53和c-Myc的调节促进肿瘤的增殖，并通过上调Bcl-2抑制细胞凋亡，该基因的高表达与有丝分裂异常导致的癌变密切相关。Lim 等［26］通过在 AT2.1和 HeLa细胞中的研究证实，OAZ1能直接结合并介导Aurora-A经非泛素化途径降解，提示OAZ1能抑制细胞的癌变。此外，OAZ1基因可在正常组织中广泛地表达，但在癌变组织中表达减少或不表达。这样的分布特性使OAZ1成为抗肿瘤治疗的新靶点，被国内外学者广泛关注。综上所述，OAZ1通过结合ODC并介导其降解来调节ODC活性，进而调节细胞内多胺的水平，抑制肿瘤细胞生长。

2.4 OAZ1参与调节动物繁殖

近年来研究表明，OAZ1也能参与雌性动物繁殖过程的调控。Kang等［27］研究表明，产蛋期籽鹅卵巢组织中OAZ1表达量显著高于产蛋前期，OAZ1可通过抑制多胺的生物合成使卵泡发育处于静止状态，提示OAZ1表达水平的变化可能影响鹅的产蛋性能。宿甲子等［28］研究表明，籽鹅卵巢内OAZ1基因的相对表达量产蛋期是产蛋前期的3.54倍，提示OAZ1可能通过调控卵泡细胞的发育，影响鹅的产蛋性能。作者应用实时PCR技术定量检测了产蛋期四川白鹅小黄卵泡和F1级卵泡颗粒层中OAZ1基因的表达量，结果表明小黄卵泡颗粒层中OAZ1的表达量极显著高于F1级卵泡，提示OAZ1对鹅卵泡发育具有重要的调控作用。另外，An等［29］研究发现西农萨能多胎(3羔)奶山羊卵巢组织中OAZ1基因的表达量比高于单胎奶山羊的高1.41倍，提示OAZ1可能促进西农萨能奶山羊的卵泡发育和排卵。总之，目前的研究结果表明，OAZ1具有调控动物卵泡发育和动物繁殖过程的重要作用，但是其确切的作用机理仍不清楚，有待进一步研究阐明。

3 抗酶抑制因子和天门冬酰胺对OAZ1的调节

在哺乳动物细胞中，所有抗酶蛋白的活性都能被抗酶抑制因子(antizyme inhibitor，AZIN)抑制。AZIN与ODC有较高的同源性，并被认为是ODC的衍生物，但后续的克隆和测序证明AZIN是一种与ODC截然不同的蛋白质。AZIN可以与OAZ1结合，且AZIN与OAZ1的亲和力远大于与ODC的亲和力，因而，AZIN能竞争性结合ODCOAZ1复合体中的OAZ1，从而恢复ODC的酶活性［30］。一般而言，氨基酸缺乏将抑制蛋白质的合成，而OAZ1的合成则在氨基酸缺乏时完成，而且一些特殊的氨基酸将抑制OAZ1的合成。研究表明，哺乳动物的翻译机制主要是通过mTORC1和mTORC2途径控制真核起始因子4EBP1和p70-S6核糖体蛋白激酶的磷酸化来调节的。Ray等［31］研究证明，尽管氨基酸调节蛋白质的翻译普遍依赖于mTORC1途径，但OAZ1的合成则依赖mTORC2途径转导信号，天门冬酰胺可通过影响mTORC2途径显著降低OAZ1基因表达，抑制OAZ1的翻译，提示天门冬酰胺是通过抑制OAZ1的翻译来调节ODC活性的。

4 小结

OAZ1具有特殊的+1移码机制，是多胺诱导的可反馈调控多胺生成和多胺转运的蛋白质。OAZ1能参与细胞周期的调节，发挥抗肿瘤效应，近年来的研究表明OAZ1还可通过调节卵泡的生长发育及排卵过程参与调控动物的繁殖。然而，目前有关OAZ1功能的研究仍然存在一些尚未解决的问题:1)OAZ1介导ODC非泛素化降解的机制以及调控多胺跨膜物质转运的分子机制仍不清楚;2)OAZ1参与调控动物卵泡发育和繁殖过程的作用尚存在争议，而其调控机制也尚未被阐明;3)OAZ1与Cyclin D1结合调节细胞周期的机制有待进一步研究阐明;4)如何解决多胺—ODC—OAZ1环形调控模式制约多胺类似物抗肿瘤效应的瓶颈问题，仍有待进一步深入研究。

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