Toll样受体与益生菌免疫

张 玲 杨彩梅* 曹广添 肖英平 曾新福

(1.浙江大学动物科学学院，杭州 310029;2.浙江惠嘉生物科技有限公司，杭州 310030)

天然免疫应答是通过抗原呈递细胞(APC)识别吞噬病原体进行降解并呈递给T细胞来启动获得性免疫应答，同时通过合成炎性因子和细胞因子引发炎症性反应[1]。在天然免疫的识别过程中，免疫细胞表面模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)特异地识别病原微生物进化中保守的抗原分子，即病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，从而有效地监测病原微生物的入侵以及诱导机体免疫应答反应[2]。Toll样 受 体 (Toll-like receptors，TLRs)是PRRs中重要的一种，它能识别抗原引发天然免疫，使免疫细胞释放细胞因子，从而介导获得性免疫，是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。

1 TLRs结构与种类、配体以及信号转导途径

1.1 TLRs结构与种类

TLRs是识别病原体PAMP的一种Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区为含有亮氨酸重复的序列(LRR)，参与识别各种病原体;跨膜区为富含半胱氨酸的区域;胞内区含有Toll样同源结构域和分子羧基端长短不同的短尾肽组成。Toll样同源结构域与白介素1受体(IL-1R)胞浆结构域有高度同源性[1-3]。

Medzhitov等[4]鉴定并克隆了一种人的果蝇Toll同源体——TLR4。迄今为止，已经至少发现11种人的 TLRs(TLR1～TLR11)和13种鼠的TLRs(TLR1～TLR13)。鼠体内 TLR10没有功能，而TLR11有功能;人的TLR11基因由于存在终止密码子，因此不能翻译表达，所以没有功能。据报道，家禽中鸡的 TLRs有 10种，分别为chTLR1LA、chTLR1LB、chTLR2A、chTLR2B、chTLR3、chTLR4、chTLR5、chTLR7、chTLR15 和chTLR21。其中chTLR1LA、chTLR1LB 和chTLR15是禽类特有的。另外，研究还表明chTLR1、chTLR2、chTLR7存在基因倍增的现象[4-6]。据于高水等[7]报道TLR14和TLR15也相继在小鼠和鸡体内发现。

1.2 TLRs配体

TLRs通过识别病原体表面的PAMP来引发免疫反应。不同的TLRs识别不同的配体。其中，TLR1主要识别细菌的三酰基肽;TLR2主要识别细菌肽聚糖(PGN)和脂多糖(LPS);TLR3主要识别病毒双链RNA;TLR4主要识别LPS;TLR5主要识别细菌鞭毛蛋白;TLR7和TLR8可以识别单链RNA。

对鸡的TLRs配体研究还不甚成熟，最近有一些研究报道表明，chTLR1与chTLR2之间存在相互作用;chTLR1LB与chTLR2A协同识别肽聚糖;chTLR1LB和chTLR2A的重组体可以识别细胞膜上的脂蛋白Mapl-2并活化巨噬细胞;chTLR2A和chTLR1LA重组体可以识别三酰脂蛋白Pam3[6]。细胞中的chTLR2B与chTLR1LA重组体可以识别三酰多肽Pam3CSK4和二酰多肽FSL-1，产生应答并 活 化 细 胞 的 核 转 录 因 子 κB(NF-κB);chTLR2B与CD14或淋巴细胞抗原96(MD2)结合后亦能够识别LPS;因此chTLR2具有TLR2和TLR4二者的功能，chTLR2受体单体都不能诱导NF-κB的活化;chTLR15与鼠伤寒沙门氏菌有关，并且与易感染鸡品系有关，未找到其配体[8]。此外，chTLR21可以识别CpG岛以及未甲基化的寡聚核苷(ODN)[4，6]。

1.3 TLRs信号转导途径

TLRs一旦识别并结合PAMP就会导致下游信号事件和转录因子的协调激活，从而诱导抗微生物分子、化学趋化因子、细胞因子和共刺激分子的基因表达，从而激活天然免疫和获得性免疫。经研究表明，TLRs信号转导途径包括2种:一种是髓样分化因子88(MyD88)依赖途径，主要介导炎性细胞因子的产生;另一种是非MyD88依赖途径，介导调节树突状细胞(DC)的成熟以及其他免疫调节分子(如MHC、CD80等)的基因表达。研究还表明现有TLRs中除了TLR3不是通过MyD88依赖途径以外，其他受体均可通过MyD88途径进行信号转导[1-3，7，9-13]。

以下是MyD88信号转导途径:当TLRs的胞外区域与配体结合后，其胞内区与MyD88分子结合，紧接着MyD88分子与IL-1R相关蛋白激酶(IRAK)结合，然后肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)通过与IRAK-1结合而被激活，同时与泛素结合酶13(Ubc13)和泛素结合酶样蛋白1A(Uev1A)异二聚体形成复合物，催化K63泛素合成，K63泛素与联合转化生长因子激活的蛋白激酶1(TAK1)和TAK1结合蛋白复合物结合，直接激活TAK1;IκB激酶[IKK，包括催化亚基 IKKα、IKKβ以及调节亚基IKKγ(NEMO)]被募集到达TAK1，从而使 NF-κB 从 IκB 与 NF-κB 复合物中释放，从胞质转移到胞核，启动炎症应答、细胞增殖或细胞分化。TAK1亦能磷酸化丝裂原活化蛋白激酶激酶(MKK)家族，从而活化c-Jun氨基末端激酶(JNK)/活化蛋白1(AP-1)途径。同时，在浆细胞样树突状细胞(pDC)、TLR7、TLR8、TLR9活化后还存在一条pDC特异性通路，这条通路是MyD88依赖的，涉及干扰素调节因子7(IRF-7)的活化和核转位。

MyD88的非依赖途径:此途径主要是指TLR受体不通过MyD88分子而产生免疫反应。这条途径仅仅被TLR3、TLR4[含干扰素β的TIR结构域(TRIF)]及TLR5利用。TRIF活化已结合IKKi的TBK1，调节干扰素调节因子3(IRF-3)的活化和核转位，最终使干扰素β基因表达;经由MyD88非依赖途径的TLR4信号要求一个桥梁接头分子TRAM，经由TRIF活化受体交互作用蛋白(RIP1)或TRAF6导致NF-κB活化;而TLR5则直接募集TRIF，经TRAF6活化NF-κB接头分子。

2 益生菌的免疫作用

益生菌是指可以直接饲喂动物，并对宿主消化道内微生物平衡起有益作用的活的微生物。能够增强动物对肠道内有害微生物群落的抑制作用，或者通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，从而间接起到促进动物生长和提高饲料转化率的作用[14]。近年来的研究表明，益生菌可以调节宿主肠道内菌群平衡;刺激机体特异性或非特异性免疫机制，提高机体抗病能力和免疫力等作用[15-18]。

益生菌对机体的免疫作用主要体现在以下几个方面:1)益生菌可以促进免疫器官的发育。李亚杰[14]研究表明，乳酸杆菌、芽孢杆菌可以显著提高鸡脾脏、法氏囊和胸腺等的器官指数。马春全[19]研究表明，雏鸡服用乳酸杆菌和乳酸链球菌复合菌制剂，其胸腺、脾脏指数于服用4～10 d、法氏囊指数于服用7 d明显高于相应对照雏鸡。2)益生菌可以增强机体非特异性免疫和特异性免疫。益生菌可以增加B细胞的数量并且能提高抗体免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白 M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、分泌型IgA(SIgA)的水平，抑制免疫球蛋白E(IgE)水平升高;同时益生菌提高白介素7(IL-7)、白介素2(IL-2)、白介素6(IL-6)等细胞因子的水平[19-21]。钱程[22]研究表明，青春双歧杆菌和嗜酸乳杆菌对血清溶菌酶的产生具有刺激作用，并且能提高巨噬细胞的功能。Haller等[23]研究表明，乳酸杆菌能促进人外周血肿瘤坏死因子 α(TNF-α)、白介素12(IL-12)、白介素18(IL-18)等免疫细胞因子的生成。益生菌可以增加T细胞的数量并且促进T细胞的增殖;刘婷婷等[24]研究表明，丁酸梭菌可以提高溶菌酶活性及补体3(C3)水平。3)益生菌可以作为免疫佐剂。邵悦[20]和李琰[25]研究表明，益生菌能增强免疫器官对鸡新城疫(ND)疫苗的细胞和体液免疫应答，分泌细胞因子和大量特异性抗体，增强ND疫苗的免疫效果。

3 TLRs信号通路与益生菌免疫作用的关系

研究显示，益生菌对免疫功能的影响与TLRs信号通路密切相关，TLRs一旦识别并结合PAMP就会导致下游信号事件和转录因子的协调激活，从而诱导抗微生物分子、化学趋化因子、细胞因子和共刺激分子的基因表达，从而引发天然免疫和获得性免疫。益生菌可以通过影响TLRs信号通路而调节免疫反应。

益生菌可以降低患病机体内TLRs基因的表达，同时降低促炎性因子水平，提高抗炎性因子的水平，从而通过调节炎症反应，维持机体平衡与健康。Liu等[26]研究表明，在试验性坏死小肠结肠炎中，乳酸菌可以下调 IL-6、TNF-α、TLR4和 NF-κB mRNA水平，显著提高前抗炎因子IL-10的水平。刘翔[27]研究发现，双歧杆菌 CMS005治疗幽门螺旋杆菌感染小鼠时显著降低了胃黏膜内TLR4、白介素 1β(IL-1β)、TNF-α 和 IL-12 基因的表达，并且 TLR4基因表达量与 IL-1β、TNF-α和IL-12基因表达量呈正相关。同时刘翔等[28]研究表明，在幽门螺旋杆菌感染的小鼠中益生菌治疗组中TLR4、MyD88和IL-1β基因表达量均显著低于感染组，同时TLR4与MyD88基因表达量呈正相关。刘伟[29]研究表明，双歧三联活菌可明显降低三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎大鼠结肠上模式识别受体TLR2、TLR4及p65 NF-κB基因的表达;并且Peyer氏淋巴(PP)结免疫细胞产生的促炎症性细胞因子 TNF-α、干扰素 γ(IFN-γ)和IL-12水平降低，抗炎性细胞因子白介素10(IL-10)水平增加。王学红[30]研究表明，益生菌CMSH006菌株下调溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜TLR2，TLR4的基因过量表达，同时抑制IL-1β基因的表达，阻止白介素4(IL-4)基因表达量的下降。Weiss等[31]研究显示，乳酸菌可以通过TLR受体机制诱导病毒免疫防御基因，乳酸菌可以诱导TLR3、IL-12、IL-10、IFN-β 基因的表达，但在 TLR2基因缺失的DC细胞中，IFN-β产生的量大量减少，该作者提出某些乳酸菌通过依赖IFN-β的TLR2途径，在DC细胞中引起病毒防御基因的表达。综上可以看出，益生菌可以通过调节促炎因子和抗炎因子平衡，下调TLRs基因的表达来调节机体免疫。

益生菌可以通过正常机体内TLRs与细胞因子来增强免疫反应。Castillo等[32]研究表明，益生菌可以提高健康小鼠体内TLR2、TLR4、TLR9基因的表达，同时可以提高 TNF-α、IFN-γ和 IL-10的水平。王艳丽等[33]研究表明，干酪乳酸杆菌可以明显提高TLR2和甘露醇受体(CD206)阳性细胞数。邹明明[34]研究表明，乳酸杆菌DM9811肽聚糖可以促进巨噬细胞表面表达TLR2、TLR4，同时可以促进免疫细胞的增殖分裂，增强某些细胞因子的表达，主要表现为上调IL-12和TNF-α基因的表达来对先天性免疫反应进行调节。张琳等[35]研究表明，乳酸杆菌制剂可减轻应用抗生素大鼠体内TLRs mRNA转录受抑程度。Gao等[36]研究发现，丁酸梭菌激活HT-29细胞中TLR2-My88不依赖信号转导途径，用RNA干扰 MyD88分子，对NF-κB、白介素 8(IL-8)、IL-6 和 TNF-α 基因的表达无显著影响，但是敲除TLR2基因后NF-κB基因的表达量下降，丁酸梭菌可以提高TLR2 mRNA水平，但是MyD88分子水平并未上调，说明丁酸梭菌通过TLR2基因诱导细胞反应。

另外，益生菌及其相关物质可以通过影响免疫细胞来调节免疫反应，Gomez-Llorente等[37]研究表明，益生菌可以调节自身免疫耐受反应，而DC细胞通过TLR受体来对微生物信号进行应答，同时 TLR调节信号可以通过诱导 CD80、CD83、CD88和CCR7的上调来控制DC的成熟。Gad等[38]研究表明，益生菌可以通过调节DC细胞来调节T细胞的分化来产生不同的免疫反应。

4 小结

益生菌制剂作为一种很有前景的抗生素替代物受到广泛的关注，对于益生菌影响免疫作用的机制已有一定的研究，但大多停留在对细胞因子和免疫球蛋白的影响等方面，对于益生菌对免疫过程细胞信号通路方面的影响方面的研究较少，而TLRs信号通路是免疫过程的重要信号通路，因此有必要对益生菌和TLRs信号通路的关系进行深入研究，进一步揭示益生菌影响免疫的机制。

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