饲料中添加小肽对星斑川鲽幼鱼生长性能、体组成及血清生化指标的影响

姜柯君 王际英 张利民 柳旭东 张德瑞 孙永智

(1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306;2.山东省海洋水产研究所，烟台 264006)

近年来，我国水产养殖业迅猛发展，养殖模式趋于集约化。随着养殖密度的加大，抗生素和渔用药物的不合理使用、水产品药残和环境污染等问题日益突出。从营养学角度入手，选择安全、健康、无污染的饲料添加剂可在一定程度上促进水产动物对饲料的消化利用，提高其生长性能及抗病力。近年来，许多学者发现，在动物消化道蛋白质水解产物中，有很大一部分为小肽(一般含2～3个氨基酸残基)，它们以完整形式直接被机体吸收利用[1-3]，在蛋白质消化、吸收和代谢中起重要作用[4-5]。大量研究证实，小肽具有促生长、诱食、促进脂肪代谢、增强机体免疫及抗氧化能力等作用[6-16]。

星斑川鲽(Platichthys stellatus，Pallas 1788)又称星突江鲽，隶属鲽形目(Pleuronectiformes)鲽科(Pleuronectidae)鲽亚科(Pleuronectinae)川鲽属(Platichthys)，俗称珍珠鲽、沼鲽等。星斑川鲽是底栖海水鱼类，其性情温顺、广温广盐[17]，适宜集约化养殖;同时，其肉味鲜美、口感好、富含胶原蛋白，而且冷藏后肉质基本不变，是一种极具商业开发价值的海水鱼类。然而，有关星斑川鲽饲料添加剂的研究报道较少，其中小肽对星斑川鲽的影响尚未见报道。本试验以星斑川鲽幼鱼作为试验动物，旨在探究饲料中添加不同水平的小肽对其生长性能、体组成及血清生化指标的影响，为星斑川鲽配合饲料的基础研究和生产实践提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用小肽购自美国华达生物科技有限公司，该小肽以鳕鱼为原料，采用复合酶系的酶解反应，经固液分离、筛选提纯、冷冻干燥等工艺生产所得。产品为浅棕色粉末状固体，基本营养成分为:粗蛋白质 48.00%，粗脂肪 10.32%，灰分19.84%，水分8.60%。参照文献[12]的方法，利用高效液相色谱仪(安捷伦1200系列)，配备TSKGel G2000 SWXL柱，通过高效凝胶过滤色谱法测定小肽分子质量，其中2～3肽(200～500 u)含量为40.51%，小肽分子质量分布见表1。

表1 小肽分子质量分布Table1 Molecular mass distribution in small peptides %

1.2 试验饲料

以鱼粉、酪蛋白、大豆浓缩蛋白等为主要蛋白质源，鱼油为脂肪源，分别添加0、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%和1.50%的小肽，制成6种试验用配合饲料，并分别编号为 S0、S1、S2、S3、S4、S5。试验饲料组成及营养水平见表2。

1.3 试验设计与饲养管理

试验用星斑川鲽幼鱼购自荣成港西水产养殖场，驯养2周后进行分组。选取规格均匀、体健无伤、平均体重为(15.30±0.03)g的幼鱼540尾，随机分为6组，每组3个重复，每个重复30尾鱼，以重复为单位放养于全封闭循环养殖桶内。正式试验开始后各组随机饲喂1种试验饲料，以饲喂未添加小肽的试验饲料的组为对照组。

养殖试验在微流水环境中进行，保证溶氧＞5 mg/L，控制水温在17～19℃，pH 7.8～8.2，盐度28～30，亚硝酸氮、氨氮均小于0.1 mg/L。每天08:00和16:00定时饱食投喂，根据鱼体重、摄食情况及时调整投喂量，同时记录投喂量。投喂30 min后，将残饵吸出，计算残饵重。饲养期为8周。

1.4 样品采集和分析

生长试验结束后，对试验鱼饥饿24 h，每桶整体称重后，随机取18尾鱼，其中3尾作为全鱼常规营养成分分析样品，其余的称体重、测体长后尾静脉采血。血液于4℃静置，4 000 r/min离心10 min，取上清液，储存于-70℃，用于血清生化指标(代谢、免疫和抗氧化指标)的测定。采血后的鱼分离背肌用于常规营养成分分析。

生长指标计算公式如下:

饲料、全鱼和背肌中的水分含量采用105℃恒重法测定，粗蛋白质含量采用凯氏定氮法测定，粗脂肪含量采用索氏抽提法测定，灰分含量采用马福炉550℃灼烧法测定。血清中总胆固醇(total cholesterol，TCHO)和甘油三酯 (triacyglycerol，TG)含量采用日立全自动生化分析仪(7020型，Hitachi)测定，血清丙二醛(maleic dialdehyde，MDA)、总蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、球蛋白(globulin，GLB)含量以及溶菌酶(lysozyme，LSZ)、过氧化氢酶(catalase，CAT)活性采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。

表2 试验饲料组成及营养水平(干物质基础)Table2 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

1.5 试验数据统计分析

数据采用Excel 2003和SPSS 13.0软件进行统计，以平均值±标准差的形式表示，采用Duncan氏法进行多重比较，显著水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 饲料中添加小肽对星斑川鲽幼鱼生长性能的影响

由表3可知，随着小肽添加量的提高，星斑川鲽幼鱼的增重率先上升后下降，在1.00%添加组达到最高，除0.25%添加组外，各添加组均显著高于对照组(P＜0.05);摄食率也呈现相似的趋势，0.75%和1.00%添加组显著高于对照组(P＜0.05);各添加组的末体重和蛋白质效率均高于对照组，其中0.75%和1.00%添加组的末体重显著高于对照组(P＜0.05)，0.05%、0.75%、1.00%和1.50%添加组的蛋白质效率显著高于对照组(P＜0.05);特定生长率以1.00%添加组为最高，除0.25%添加组外，各添加组均显著高于对照组(P＜0.05);与对照组相比，各添加组的饲料系数均显著降低(P＜0.05)。以增重率为指标，得到增重率和小肽添加量之间的回归关系，如图1所示，回归方程为:Y=-55.003X2+101.93X+95.235(R2=0.971 8)，经计算，饲料中小肽的最适添加量为0.93%。

表3 饲料中添加小肽对星斑川鲽幼鱼生长性能的影响Table3 Effects of small peptides supplementation on growth performance of juvenile starry flounder(Platichthys stellatus)

图1 小肽添加量与增重率的回归关系Fig.1 Regression relationship between small peptidessupplemental level and WGR

2.2 饲料中添加小肽对星斑川鲽幼鱼体组成的影响

由表4可知，全鱼的水分、粗蛋白质、粗脂肪和灰分含量各组之间均无显著差异(P＞0.05)。随着小肽添加量的提高，背肌粗脂肪含量先下降后上升，以0.75%添加组为最低，除0.25%添加组外，其他各添加组均显著低于对照组(P＜0.05);1.00%和1.50%添加组的背肌粗蛋白质含量显著高于对照组(P＜0.05);背肌水分和灰分含量各组之间无显著差异(P＞0.05)。

表4 饲料中添加小肽对星斑川鲽幼鱼体组成的影响Table4 Effects of small peptides supplementation on body composition of juvenile starry flounder(Platichthys stellatus)

2.3 饲料中添加小肽对星斑川鲽幼鱼血清生化指标的影响

由表5可知，对于脂肪代谢指标，各添加组的血清总胆固醇含量均低于对照组，且0.50%添加组降低显著(P＜0.05);与对照组相比，各添加组的血清甘油三酯含量均显著降低(P＜0.05)，各添加组之间无显著差异(P＞0.05)。对于蛋白质代谢指标，1.00%添加组的血清总蛋白含量显著高于对照组(P＜0.05);血清球蛋白含量随小肽添加量的提高先升高后降低，除1.50%添加组外，各添加组均显著高于对照组(P＜0.05);血清白蛋白含量各组之间无显著差异(P＞0.05)。

由表6可知，各添加组的血清溶菌酶活性均显著高于对照组(P＜0.05)，其中以1.00%添加组为最高;1.00%添加组的血清过氧化氢酶活性显著高于对照组(P＜0.05)，血清丙二醛含量显著低于对照组(P＜0.05)。

表5 饲料中添加小肽对星斑川鲽幼鱼血清脂肪和蛋白质代谢指标的影响Table5 Effects of small peptides supplementation on metabolism indices of lipid and protein in serum of juvenile starry flounder(Platichthys stellatus)

表6 饲料中添加小肽对星斑川鲽幼鱼血清免疫和抗氧化指标的影响Table6 Effects of small peptides supplementation on serum immune and antioxidant indices of juvenile starry flounder(Platichthys stellatus)

3 讨论

3.1 饲料中添加小肽对星斑川鲽幼鱼生长性能的影响

本试验结果显示，星斑川鲽幼鱼生长性能受到小肽添加量的影响显著，其中增重率和特定生长率随添加量的提高呈先上升后下降的变化，饲料系数显著降低，蛋白质效率显著提高，表明添加适量小肽能促进星斑川鲽幼鱼生长，提高饲料利用率和蛋白质利用率，与前人研究结果[6-11，13]类似，Yu 等[6]、Erba 等[7]、薛敏等[8]、McLean 等[9]、Zambonino 等[10]、Leonard 等[11]和 Refstie 等[13]均发现饲料中添加小肽有明显的促生长作用。同样，于辉等[15]在草鱼(Ctenopharyngodon idella)饲料中添加酪蛋白小肽，试验组草鱼的相对生长率、蛋白保留效率、饲料利用率均较对照组表现得好。Kotzamanis等[12]在饲料中添加10%的商品小肽，欧洲鲈鱼(Dicentrarchus labrax)表现出良好的生长性能，而本试验在小肽添加量为1.00%时星斑川鲽幼鱼已表现出较好的生长性能，出现上述差异的原因可能与小肽构成成分有关。目前来看，小肽促进星斑川鲽幼鱼生长的原因可能有以下3点:第一，小肽作为蛋白质的水解产物，能被机体直接吸收利用[1-3，9，18]，加快蛋白质的吸收，从而减少机体分解蛋白质耗能，节约能量用于生长[3];第二，小肽具有吸收速度快、耗能低、载体不易饱和等吸收特点[19]，可提高氨基酸的吸收速度，从而提高鱼体对饲料中蛋白质的利用率;第三，多种生物活性小肽可在消化道中释放出来，促进肠道蠕动，改善消化机能，促进动物的生长[20]。本试验中，小肽添加量为0.75% ～1.00%时，星斑川鲽幼鱼生长性能表现最好，过多添加对其生长未产生促进作用，与 Erba 等[7]、Zambonino 等[10]报道 一 致。Cahu等[14]研究发现，用含小肽的商品鱼粉水解物替代25%的鱼粉时，促进了海鲈(Dicentrarchus labrax)幼鱼的生长，但当替代50%和75%的鱼粉时，对生长却有抑制作用。Kotzamanis等[12]用含小肽的商品鱼粉水解物替代10%的鱼粉时，显著促进了欧洲鲈鱼的生长，但当替代19%的鱼粉时，则对生长有抑制作用。Zambonino等[10]研究发现饲料中高水平的小肽会显著影响胰岛素的合成和分泌，从而抑制鱼体生长。过量添加小肽未促进鱼体生长，可能存在2个方面的原因:一方面是高水平的小肽致使肽转运机制饱和;另一方面是低分子质量肽的快速水解，产生过多的氨基酸，使肠道的氨基酸转运系统饱和[12，14]。

本试验中，饲料中添加小肽后，星斑川鲽幼鱼的摄食率升高，在添加量达到0.75%后甚至达到显著水平，表明小肽具有一定的促进摄食的功效，与 Refstie等[13]和 Cahu 等[14]的结论一致。小肽促进摄食的原因可能是在小肽水解过程中产生了一些具有生物活性的肽[12]，部分肽具有诱食作用。

3.2 饲料中添加小肽对星斑川鲽幼鱼体组成的影响

星斑川鲽幼鱼全鱼和背肌的常规成分分析中，水分、灰分含量无显著性差异，粗脂肪含量以对照组最高，这与于辉等[15]的研究结果相似。引起此现象的可能原因有2点:一是添加小肽后提高了机体蛋白质的合成，降低了游离氨基酸转化为脂肪在鱼体中的沉积[21];二是小肽能阻碍脂肪的吸收，并能促进脂质代谢[22]，其进一步的机理有待研究。此外，背肌粗蛋白质含量在小肽添加量为1.00%和1.50%时显著高于对照组。这可能是因为小肽与游离氨基酸具有相互独立的吸收机制[23]，可减轻由于游离氨基酸相互竞争吸收位点而产生的拮抗作用;而且小肽吸收速度快，吸收峰高，能快速提高动静脉的氨基酸差值，提高整体蛋白质合成[24]。同时，小肽独特的吸收机制使其中的氨基酸吸收速度大于游离氨基酸，从而提高试验鱼对蛋白质的利用[25]。

3.3 饲料中添加小肽对星斑川鲽幼鱼血清生化指标的影响

胆固醇和甘油三酯的含量反映了动物体内的脂肪沉积情况[5]。本试验中，各添加组总胆固醇和甘油三酯的含量均低于对照组。分析其原因可能是小肽的添加加速了脂类的代谢，降低了血清中脂肪的含量[22，26]。血清总蛋白是机体蛋白质代谢水平的重要参考指标之一，可以用来衡量蛋白质和氨基酸的利用率[16，27]，主要分为白蛋白和球蛋白，白蛋白作为营养物质载体，维持血液渗透压[16，28]，球蛋白来源于浆细胞的分泌，反映机体的抵抗力[28]。研究指出，添加小肽会提高血液中球蛋白的数目，球蛋白可以激活体内的白细胞，发挥免疫作用[16]。本试验中血清总蛋白和球蛋白含量随小肽添加量的提高呈先升高后降低的趋势，表明适量小肽的添加能在一定程度上促进血清蛋白质的合成，提高机体球蛋白含量，进而提高机体的免疫力。

鱼类的免疫系统不够完善，溶菌酶作为鱼类非特异性免疫的重要组成成分，在鱼体的防御机制中起着重要作用[26]。溶菌酶不仅能水解细菌细胞壁而致细菌死亡，还可诱导调节其他免疫因子的合成与分泌[29]，在一定程度上，溶菌酶与免疫球蛋白、白细胞在功能上呈正相关[30-34]。本试验中，饲料中添加小肽后血清溶菌酶活性升高，进而可能诱导其他免疫因子[29，35]，共同参与机体免疫，提高机体免疫力。小肽提高免疫的另一个原因可能是小肽的水解过程中产生了免疫刺激肽和抗菌肽等免疫活性肽[36]，这些活性肽参与鱼体内的免疫系统调节，提高鱼体的免疫力。

自由基具有极强的氧化还原能力，过多存在会造成动物组织氧化损伤，所以机体必须具备一套有效的抗氧化防御机制来调节自由基的平衡[37]。过氧化氢酶是机体清除氧自由基的重要的酶系[38]，丙二醛是脂质过氧化产物[39]。这2个指标能有效地体现机体的抗氧化能力。本试验中，随着小肽添加量的提高，血清过氧化氢酶活性先上升后下降，血清丙二醛含量则先下降后上升，表明适量添加小肽能有效增强酶促反应防御系统中各种酶的活性，清除体内过多的活性自由基，增强机体抗氧化能力，减少机体脂质过氧化，从而增强机体免疫能力。过多添加小肽并未提高机体的抗氧化能力，分析其原因可能是过量小肽的促脂质过氧化作用的结果[39]。

4 结论

①饲料中添加小肽影响星斑川鲽幼鱼的生长性能，根据增重率得出的最适添加量是0.93%。

②饲料中添加小肽影响星斑川鲽幼鱼的免疫和抗氧化能力，其最适添加量是1.00%。

③在本试验条件下，综合考虑增重率以及免疫和抗氧化指标，得出最适宜的小肽添加量为0.93% ～1.00%。

[1]AGAR N S.Glutathione polymorphism in the sheep red blood cells[J].International Journal of Biochemistry，1975，6(12):843-852.

[2]CARRIGAN C N，IMPERIALI B.The engineering of membrane-permeable peptides[J].Analytical Biochemistry，2005，341:290-298.

[3]WEBB K E.Intestinal absorption of protein hydrolysis products:a review[J].Journal of Animal Science，1990，68(9):3011-3022.

[4]JENSEN L S.Are peptides needed for optimum animal nutrition?[J].Feed Management，1991，42:37-40.

[5]李富伟，蔡辉益.肽对肉鸡生长性能的影响及其生理机理研究[J].动物营养学报，2005，17(1):40-44.

[6]YU Y M，ALI J W，PAN W H，et al.Effects of peptides，with emphasis on feeding，pain，and behavior[J].Peptides，2004，25:2257-2289.

[7]ERBA D，CIAPPELLANO S，TESTOLIN G.Effect of casein phosphopeptides on inhibition of calcium intestinal absorption due to phosphate[J].Nutrition Research，2001，21:649-656.

[8]薛敏，解绶启，崔奕波，等.鱼类促摄食物质研究进展[J].水生生物学报，2003，27(6):639-643.

[9]MCLEAN E，RONSHOLDT B，STEN C，et al.Gastrointestinal delivery of peptide and protein drugs to aquacultured teleosts[J].Aquaculture，1999，177:231-247.

[10]ZAMBONINO L J，CAHU C，PERES A.Partial substitution of di-and tripetides for native proteins in sea bass diets improves Dicentrarchus labrax larval development[J].Nutrition，1997，127:608-614.

[11]LEONARD A，MAYNARD A B.Animal nutrition[M].New York:Mc Graw-Hill Book Company，2000:234-249.

[12]KOTZAMANIS Y P，GISBERT E，GATESOUPE F J，et al.Effects of different dietary levels of fish protein hydrolysates on growth，digestive enzymes，gut microbiota，and resistance to Vibrio anguillarum in European sea bass(Dicentrarchus labrax)larvae[J].ComparativeBiochemistry and Physiology，2007，147:205-214.

[13]REFSTIE S，OLLI J J，STANDAL H.Feed intake，growth，and protein utilisation by post-smolt Atlantic salmon(Salmo salar)in response to graded levels of fish protein hydrolysate in the diet[J].Aquaculture，2004，239:331-349.

[14]CAHU C L，ZAMBONINO I J，QUAZUGUEL P，et al.Protein hydrolysate vs.fish meal in compound diets for 10-day old seabass Dicentrarchus labrax larvae[J].Aquaculture，1999，171(1):109-119.

[15]于辉，冯健，刘栋，等.酪蛋白小肽对幼龄草鱼生长和饲料利用的影响[J].水生生物学报，2004，28(5):526-530.

[16]ZHOU S，WANG G B，YANG Z B.Study on effect of plant small peptides on blood biochemical indexes and gut flora of suckling piglets[J].Chinese Journal of Animal Nutrition，2008，20(1):40-45.

[17]段培昌，张利民，王际英，等.新型蛋白源替代鱼粉对星斑川鲽幼鱼生长、体成分和血液学指标的影响[J].水产学报，2009，33(5):797-803.

[18]田刚，余冰，张克英，等.蛋清小肽混合物对两种免疫状态小鼠生产性能、血清生化指标及生长激素水平的影响[J].动物营养学报，2008，20(4):453-457.

[19]冯秀燕，计成.寡肽在蛋白质营养中的作用[J].动物营养学报，2001，13(3):8-13.

[20]CLARE D A，SWAISGOOD H E.Bioactive milk peptides:a prospectus[J].Journal of Dairy Science，2000，83:1187-1195.

[21]BOZA J J，MOENNOZ D，VUICHOUD J，et al.Protein hydrolysate vs.free amino acid-based diets on the nutritional recovery of the starved rat[J].EuropeanJournal of Nutrition，2000，39:237-243.

[22]CHRISTIAN A D.Fatty acids and expression of adipokines[J].Biochimica ＆ Biophysica Acta:Molecular Basis of Disease，2005，1740:287-292.

[23]蒋步国，冯健，黄钧，等.酪蛋白小肽和氨基酸对草鱼血液循环和组织蛋白质合成的影响[J].海洋与湖沼，2010，41(1):75-79.

[24]BOSISCLAIR Y R，BELL A W，DUNSHEA F R，et al.Evaluation of the arteriovenous difference technique to simultaneously estimate protein synthesis and degradation in the hindlimb of fed and chronically underfed steers[J].The Journal of Nutrition，1993，123(6):1076-1088.

[25]BAMBA T，KUSE K，OBATA H，et al.Effects of small peptides as intraluminal substrates on transport carriers for amino acids and peptides[J].Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition，1993，15:33-42.

[26]舒美艳，许国焕，吴月娥，等.乳源活性肽对罗非鱼生长性能和血清生化指标的影响[J].动物营养学报，2009，21(2):219-225.

[27]钱云霞，陈惠群，孙江飞.饥饿对养殖鲈鱼血液生理生化指标的影响[J].中国水产科学，2002，9(2):133-136.

[28]徐奇友，王常安，许红，等.大豆分离蛋白替代鱼粉对哲罗鱼稚鱼生长、体成分和血液生化指标的影响[J].水生生物学报，2008，32(6):941-946.

[29]郑清梅，吴锐全，叶星.水生动物溶菌酶的研究进展[J].上海水产大学学报，2006，15(4):483-487.

[30]MARJA M，ANTTI S.Changes in plasma lysozyme and blood leucocyte levels of hatchery-reared Atlantic Salmon(Salmo salar L.)and sea trout(Salmo trutta L.)during parr-smolt transformation[J].Aquaculture，1992，106:75-78.

[31]YIN G J，GALINA J，RACZ T，et al.Effect of two Chinese herbs(Astragalus radix and Scutellaria radix)on non-specific immune response of tilapia，Oreochromis niloticus[J].Aquaculture，2006，253:39-47.

[32]王文博，方平，林小涛，等.甘草粗提物对鲫的免疫调节作用[J].水生生物学报，2007，31(5):655-671.

[33]BRICKNELL I，DALMO R A.The use of immunostimulants in fish larval aquaculture[J].Fish ＆ Shellfish Immunology，2005，19(5):457-472.

[34]汪开毓，陈霞，黄锦炉，等.无花果多糖对鲫鱼非特异性免疫功能的影响[J].水生生物学报，2011，35(4):630-637.

[35]张世卿，朱忠珂，王明成，等.玉米-豆粕日粮添加溶菌酶对肉仔鸡生长性能、代谢及免疫指标的影响[J].动物营养学报，2008，20(4):463-468.

[36]DAOUD R，DUBOIS V，BORS-DODITA L，et al.New antibacterial peptide derived from bovine hemoglobin[J].Peptides，2005，26:713-719.

[37]MOURENTE G，DIAZ-SALVAGO E，BELL J G，et al.Increased activities of hepatic antioxidant defence enzymes in juvenile gilthead sea bream(Sparus aurataL.)fed dietary oxidised oil:attenuation by dietary vitamin E[J].Aquaculture，2002，214:343-361.

[38]MATHEW S，ASHOK K K，ANANDAN R，et al.Changes in tissue defence system in white spot syndrome virus(WSSV)infected Penaeus monodon[J].Comparative Biochemistry Physiology Part C:Toxicology ＆ Pharmacology，2007，145(3):315-320.

[39]刘晓华，曹俊明，吴建开，等.饲料中添加谷胱甘肽对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化指标和脂质过氧化物含量的影响[J].水产学报，2007，31(2):235-240.