脱氧雪腐镰刀菌烯醇对肠道屏障的影响及其作用机制

熊 霞 杨焕胜 印遇龙

(中国科学院亚热带农业生态研究所，中国科学院亚热带农业生态过程重点实验室，湖南省畜禽健康养殖工程技术中心，农业部中南动物营养与饲料科学观测实验站，长沙 410125)

真菌毒素是真菌在应激下产生的高毒性低分子质量的二级代谢物，对人类和动物健康具有潜在危害。真菌毒素对作物(小麦、大麦、燕麦、玉米等)的污染是一个全球性的问题，导致了农业产业中的重大经济损失。据统计，大概全球25%的作物被真菌毒素污染[1]。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又名呕吐毒素，是一种单端孢霉烯族毒素，主要由镰刀菌(Fusarium spp.)产生。这种毒素化学性质稳定，在加工过程中一般不易破坏，很易于在人类的食品和动物的饲料中找到。

肠黏膜是机体与病原体和毒素接触的第1道屏障，肠道单层柱状细胞(肠上皮细胞)通过顶端连接复合体彼此连接。连接复合体可阻止异型生物质和微生物进入到机体，但允许营养物质和维持机体稳态和生长的物质通过[2]。DON、赭曲霉毒素A和棒曲霉素这3种毒素是有名的肠道致病性真菌毒素，它们能改变肠道功能，导致营养不良、腹泻、呕吐和肠道炎症[3]。肠道是 DON吸收的主要部位，如自然霉变的小麦进入猪体内后大概15 min即可在血液中检测到DON的存在，并在(1.65±0.79)h时浓度可达到峰值，表明DON能被快速和几乎完全地吸收[吸收率达(91.5±27.4)%][4]。摄入中到高剂量的DON如何影响免疫系统已经很清楚[1]，但目前对DON在肠道中的作用机制了解甚少。近年来的研究表明，DON抑制了肠道对营养物质的吸收，破坏肠道屏障和细胞紧密连接，引起了肠道炎症，并改变了肠道微生物组成。本文将围绕DON对肠道屏障的影响及其作用机制进行综述。

1 DON影响肠上皮细胞对营养物质的吸收

含真菌毒素的饲料被动物机体消化后，首先与肠道上皮细胞接触。肠道对营养物质(如葡萄糖和氨基酸等)的吸收主要是通过细胞内途径，少量是由旁细胞通路途径进入。转运蛋白利用电化学梯度把葡萄糖、氨基酸和离子运输过质膜，但DON影响营养物质特别是葡萄糖的吸收。Hunder等[5]研究发现，饲喂大鼠10 mg/kg的DON 6周后极大地降低了大鼠肠道对葡萄糖的吸收。Maresca等[6]研究表明，低浓度(＜ 10 μmol/L)DON 选择性调节人肠上皮细胞转运载体的活性，而10 μmol/L的DON处理肠上皮细胞48 h后显著抑制葡萄糖钠离子依赖性转运载体(SGLT1)和果糖转运载体(GLUT5)的活性。该结果提示DON抑制蛋白质合成和诱导细胞凋亡可能是DON对肠上皮细胞毒性的主要作用机制。Award等[7]通过尤斯灌流室(Ussing chamber)检测发现，添加L-脯氨酸能增加鸡肠黏膜上的短路电流，但添加DON后则抑制了该短路电流。该结果提示DON能干扰氨基酸转运载体活性。但Zerull等[8]发现，5.7 mg/kg的DON并未对猪空肠葡萄糖转运载体蛋白的合成产生影响，原因可能是5.7 mg/kg的DON剂量并不能影响到肠道转运系统。目前DON对一些特定肠道氨基酸转运的干扰主要是发生在RNA转录水平还是蛋白质合成水平还不太清楚。DON进入机体后主要是在胃到空肠近端处被快速和有效地吸收，少部分到达小肠下端和大肠[9]，并通过肠道微生物脱环氧化代谢成毒性小的去环氧DON(DOM-1)，因此DON对大肠毒性作用较小。

2 DON对肠道屏障和细胞紧密连接的影响

肠道是抵御外来抗原入侵的最重要部位，胃肠道(从胃到结肠)屏障排列着连续的单层肠上皮细胞，其首要功能就是作为物理屏障隔离来自肠腔的有害物质[10]。肠上皮细胞通过位于相邻上皮细胞间的紧密连接(tight junction)与黏着连接(adherens junction)、缝隙连接(gap junction)和桥粒(desmosome)共同组成连接复合物。紧密连接位于连接复合体的最顶端，限制物质通过旁细胞通路转运。肠上皮细胞通过细胞连接进行紧密黏附，限制了小的亲水分子的旁路转运。跨膜蛋白如紧密连接蛋白家族(claudins)和胞浆蛋白如闭锁带蛋白家族(zonula occludens)等维持了屏障的完整性，而DON毒性的一个重要方面是损伤肠道屏障。肠上皮细胞除了维持屏障功能外，还发展了多种机制防御外来抗原入侵，包括黏液分泌、抗菌肽合成和参与细胞因子/趋化因子网络等[11]。

众所周知，DON是RNA、DNA和蛋白质合成的潜在抑制剂。DON与60S核糖体亚基中的肽基转移酶反应，诱导了所谓的“核糖体失活反应(ribotoxic stress response)”，激活了丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路[12]。MAPK通路中的信号分子能调节紧密连接的结构和功能[13]。MAPK信号通路是细胞信号转导系统的重要组成部分。目前细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38和细胞外信号调节激酶5(ERK5)/大丝裂原活化蛋白激酶-1(BMK1)等4个MAPK亚族在哺乳动物细胞中被克隆和鉴定。不同MAPK亚族被其上游激酶激活后，可通过磷酸化转录因子、细胞骨架相关蛋白和酶类等多种底物来调节多种细胞生理过程，包括传导下游的免疫反应和细胞凋亡信号[14]。Van de Walle等[15]发现 DON通过抑制蛋白质合成影响肠上皮细胞间的紧密连接，从而破坏肠道屏障，但其内在机制并不清楚。Pinton等[16]发现DON能诱导P44/42 ERK信号通路的激活，抑制紧密连接蛋白-4的表达，从而导致肠屏障功能受损。但目前人们对核糖体反应中的上游激酶如何被激活并不清楚。小肠上皮细胞单分子膜的跨上皮电阻(trans-epithelium electrical resistant，TER)被认为是上皮完整性和组织细胞单分子层紧密连接程度的一个重要指标。紧密连接蛋白表达的变化可能会减少上皮细胞层的TER，导致了细胞单分子层通透性的增加，增加了旁细胞通路转运和超大分子的吸收，增加了细菌移位的机会。Sergent等[17]的研究表明，DON在肠上皮细胞的转运主要是通过细胞旁路被动扩散，少部分是跨细胞转运。长时间暴露于DON能引起MAPK信号通路中ERK1/2、p38和应激活化蛋白激酶(SAPK)/JNK的磷酸化，减少人结肠癌上皮细胞(CaCo-2)的TER，引起肠道炎症。

3 DON对肠上皮细胞的其他影响

IPEC-J2是从未哺乳的新生仔猪空肠分离的肠上皮细胞，是非转化型的起始连续培养小肠细胞系，具有典型的猪小肠上皮细胞特性，是研究营养素等物质与小肠上皮细胞间作用机制的良好模型[18]。Diesing 等[19]用不同剂量(200和2000ng/mL)的DON处理猪IPEC-1和IPEC-J2，发现高剂量的DON能对这2种细胞产生毒性作用，包括对细胞的活性、分化、紧密连接和周期等都有影响;而低剂量的DON对细胞的影响很小，表明了低剂量与高剂量的DON在肠上皮细胞上的作用机制不同。此外，Accensi等[20]在断奶仔猪上的试验表明，低剂量(0、280、560 和 840 μg/kg)的DON并未对猪的血液生化以及免疫各指标产生影响。该结果与Doll等[21]的研究结果一致，这些结果能为猪饲料中DON的最低检测限提供依据。此外，DON对动物的影响与饲料受污染程度、动物的年龄以及饲养期有关[22]。Pestka[23]的研究表明，真菌毒素同时具备免疫激活或免疫抑制功能，这与剂量、频率、暴露时间以及免疫细胞的类型有关。肠上皮细胞的极化结构对于其功能的行使极为重要，肠上皮细胞基顶膜和基底膜分工各有不同。基顶膜上含有大量的酶和转运载体复合物，如乳糖酶、蔗糖酶和氨基肽酶等，协助肠腔营养物质的分解和吸收。而基底膜上主要以营养物质如氨基酸或糖的转运载体为主。DON被肠道吸收时与上皮细胞在基顶侧发生反应，进入到血液中的DON则通过血液与肠上皮细胞基底侧接触。Diesing等[9]检测了DON对 IPEC-J2细胞活力和紧密连接的影响，结果发现相同的DON浓度从基底侧接触比基顶侧对肠道屏障的完整性破坏更严重。此外，为了维持肠道屏障功能，上皮需要持续更新。来源于隐窝干细胞的肠上皮细胞沿隐窝-绒毛轴向绒毛端迁移，迁移过程逐渐分化为成熟的肠上皮细胞，并最终在绒毛顶端脱落，分化成熟后的肠上皮细胞有着显著的顶角结构和上千个微绒毛[24]。动物研究中把肠道形态学指标(上皮细胞增殖、隐窝深度和绒毛高度)作为检测动物是否健康的一个指标。Maresca等[6]的研究表明DON能影响人结肠上皮细胞的增殖。

4 DON对肠道炎症和肠道微生物组成的影响

目前很多研究集中在DON污染的食物或饲料对胃肠道的直接影响，尽管它们对肠道屏障和转运活性的影响已经逐渐明确，但目前人们对它们的促炎机理仍知之甚少。肠上皮细胞对外界各种刺激分泌出炎性介质，激活肠上皮细胞以下的免疫细胞，触发肠道黏膜防御中的炎症反应。单核细胞、巨噬细胞以及T淋巴细胞和B淋巴细胞是DON的作用靶标。细胞因子是小肽分子，它们对于调节免疫和炎性反应非常重要，由淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞产生。Mbandi等[25]研究表明，DON具有促进小鼠巨噬细胞趋化因子和促炎细胞因子，包括白介素 -1β(IL-1β)、白介素 -6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和巨噬细胞炎症蛋白(MIP-2)表达的作用。Maresca等[3]研究发现，DON通过调节促炎细胞因子IL-1β活性或增加肠道共生大肠杆菌的跨膜通道，间接刺激白介素-8(IL-8)的分泌。这些结果表明，DON对肠道不仅具有直接的促炎作用，也可通过肠道屏障功能改变而间接引起肠道炎症。Van de Walle等[26]在Caco-2细胞上的研究表明，DON能诱导活化核因子-κB(NF-κB)的活化及刺激IL-8的分泌，并存在剂量依赖性。而这2个因子刺激了促炎，提示高剂量的DON可能导致或加剧肠道炎症。Vandenbroucke等[27]研究了低浓度的DON与鼠伤寒沙门氏菌诱发的早期肠道炎症之间的关系，结果表明，摄入DON污染的食物或饲料后，可能导致肠上皮细胞更容易被病原体如沙门氏菌侵入，而且加重了后续的肠道炎症。Noqueira等[28]通过蛋白质组学研究了人的2种淋巴细胞系在DON处理后蛋白质的变化，发现包含在蛋白酶体降解途径中蛋白质的上调可能与转录因子的激活以及细胞因子的变化有关。

此外，肠道菌群是影响动物健康的一个重要因素，机体的免疫反应与肠道菌群发酵后的代谢产物间有着密切关系[29]。有研究者通过体外试验调查了肠道菌群和单端孢霉菌毒素之间的相互作用，以确定菌株是否能减少霉菌毒素的毒理效应，结果发现，筛选的细菌能与DON结合，并通过脱环氧化作用降低的毒性作用[30-31]。Wache 等[32]首次通过毛细管电泳单链构象多态性(CE-SSCP)在体研究了DON对肠道微生物的影响，发现DON改变了肠道微生物的组成。

5 小结

肠道是抵抗病原体和微生物入侵的第1道屏障，开展DON对肠道屏障的影响及其作用机制的研究对于调节人类和动物的健康非常有意义。抑制蛋白质合成和诱导细胞凋亡是DON的毒性机理之一，此外，它还可以通过减少细胞紧密连接蛋白来破坏肠道屏障。然而，目前对DON介导的肠上皮细胞的作用机制如“核糖体失活反应”中对上游激酶激活的影响、抗菌肽的产生等仍然了解甚少，其详细机制需要进一步的研究。在今后的研究中，应该结合分子生物学、功能基因组学等各种技术和方法，从细胞和分子水平进行深入研究，以深入揭示DON的作用机理。

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