分光光度法测定松花江水中木质素和丹宁的含量

王嘉滨

（黑龙江省质量监督检测研究院，黑龙江哈尔滨150050）

木质素和丹宁都是复杂的羟基化的芳香族化合物。由于生物降解、工业排放等，能以多种方式进入天然水中，因此，天然水耗氧量升高，溶解氧减少，造成水的污染，危害鱼类和无脊椎动物的资源及人民身体健康[1]。木质素及其衍生物是水中有机污染物之一，甚至造成二次污染源[2]。特别是利用天然水中木质素作为示踪剂，研究天然水扩散规律，更近迫切要求准确灵敏、快速的分析木质素和丹宁的方法。

国外对木质素的分析，早已引起重视，特别是荧光法测定木质素磺酸盐的文献很多。目前，国内对天然水中木质素和丹宁的分析报道不多，而且多采用美国公共卫生协会等编著的“水和废水标准检验方法”。该法所用的Folin-Denis试剂，本身存在着许多缺点，如试剂的灵敏度和常常的形成难于再现，显色不大稳定，其它羟基化芳香族化合物（酚类、腐植酸）的干扰等等。Folin-Ciocalteu进行了改进，但都没有彻底解决试剂本身非特异性的问题。

本试验考查了Folin-Denis和Folin-Ciocalteu试剂后确定了Folin-Ciocalteu试剂，在颜色稳定、防止沉淀生成和灵敏试等方面优于Folin-Denis试剂。

将干扰测定的一些有机物（酚类、腐植酸）在XAD-2小玻璃填充柱上分离。干扰测定的某些无机离子用络合掩蔽消除。并用Folin-Ciocalteu试剂对松花江水在700nm处（从600~755nm，符合Beer定律）直接进行木质素和丹宁的分光光度法测定。本实验方法最小检测量为0.01mg·L-1的丹宁含量。同时初步考察了在275nm处用紫外光谱法对木质素和丹宁的测定。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

T6新世纪紫外分光光度计；1.0cm石英池；PHS-3C型酸度计；实验室常用玻璃仪器。

本实验所用的试剂均为分析纯；

Amberlite XAD-2树脂系由Rohm and Hass制造（经乙睛、丙酮、乙醚有机溶剂抽提纯化后，备用吸附剂）；

Folin-Denis试剂：往750g水中加入100g钨酸钠、20g磷钼酸和50mL磷酸（85%）。这些物质在带有回流冷凝器烧瓶里煮沸2h，冷却到25℃，并稀释至1000mL；

Folin-Ciocalteu试剂：称取100g钨酸钠（Na2WO4·2H2O）、25g钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）和700mL蒸馏水，一起转移到1500mL平底烧瓶里，然后取50mL 85%磷酸和100mL浓盐酸加入平底烧瓶里。平底烧瓶连接一个回流冷凝器，将该混合液缓缓地煮沸10h，在煮沸结束之前，加入150g硫酸锂、50mL水和几滴液体Br2。该混合液在不带冷凝器的烧瓶里，再煮沸15min，除掉过量的溴，然后冷却到25℃，稀释至1000mL。

1.2 标准溶液配制

丹宁的标准溶液：称取干燥恒重的丹宁（分析纯、德国产）0.1000g，溶于蒸馏水中，用蒸馏水稀释至100mL，放置在冰箱内保存。使用时，取100mL标准液，稀释至1000mL（其浓度为0.01mg·mL-1）

木质素的标准溶液：取造纸厂的黑液，用HCl酸化，调节pH值至3左右，析出的木质素，用20~30mL乙醚洗涤3次，洗去沉淀物上吸附的松香树脂之类的干扰物质，最后用玻璃水泵将沉淀抽干，放置在真空干燥器内，并称至恒重。

称取上述自制的木质素0.1000g，加入几滴0.1mol· L-1Na2CO3溶液，使之溶解后，加入蒸馏水，调节pH值至中性，移入100mL溶量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度（其浓度为1mg·mL-1），放入冰箱内保存，使用时取10mL上述溶液，用蒸馏水稀释至1000mL（其浓度为0.011mg·mL-1）,以备实验用。

饱和Na2CO3溶液：称取200g Na2CO3，溶于500mL蒸馏水中，并用蒸馏水稀释至1000mL，储于带橡皮塞的瓶中。

Na2CO3-酒石酸溶液：称取200g Na2CO3和12g酒石酸钠，溶于750mL热的蒸馏水中，冷却至室温，用蒸馏水稀释至1000mL。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的选择

2.1.1 试剂的颜色和空白Folin-Denis试剂是蓝-绿颜色，这是因为回流时间短，使钨酸钠（钼酸钠）转化到磷钨酸钠（磷钼酸钠）不完全的原因，Folin-Ciocalteu试剂，采用加入溴而除去这些还原产物，不仅使颜色（黄色）稳定，而且还降低了试剂的空白，实验得Folin-Denis比Folin-Ciocalteu试剂空白高二倍，而且Folin-Ciocalteu试剂空白非常稳定。

在Folin-Denis试剂的沉淀中，发现有钨（钼）的钠盐络合物。Folin-Ciocalteu试剂，由于加入锂盐避免了沉淀的产生，钨（钼）的锂盐络合物比钠的络合物易于溶解。实验表明：Folin-Ciocalteu试剂，保存一年仍然稳定，测定数据重现。

2.1.2 温度的影响 温度对显色时间有很大的影响，Folin-Denis试剂加入碳酸盐后，大约20min左右就出现沉淀，颜色不稳定。而Folin-Ciocalteu试剂显色30min至4h，都能保持颜色稳定，测量在20℃以上，得到最大准确度。如果室温低于20℃由于显色放慢，显色时间最好在1h（或1h以上）再进行测量。

2.1.3 有机干扰物-酚类和腐植酸的分离 酚类和腐植酸对Folin-Denis和Folin-Ciocalteu两种试剂用分光光度法分析木质素和丹宁，都给出正的干扰。分离天然水中酚类和腐植酸的方法很多，但吸附分离法，可以简化操作，同时可实现连续化和自动化。

本实验选用XAD-2为吸附剂，将它填充到10cm×0.8m2的玻璃柱中，腐植酸的分离是将水样用盐酸酸化至pH=2.2，而分离酚类用磷酸将水样酸化到pH=4.0，两者都以4mL·min-1流量，流经吸附柱。腐植酸和酚类分别吸附在XAD-2吸附柱上（用0.2mol·L-1NaOH溶液及二氯甲烷脱附），流经吸附柱后的水样供分光光度法测定。

2.1.4 pH值的影响取10mL（浓度为0.01mg·mL-1）标准的木质素和丹宁溶液，分别加入1mLFolin-Cioc alteu试剂，静止5min后加入不同量的碳酸钠-酒石酸钠，用蒸馏水稀释至100mL，以蒸馏水作为空白，在700nm处，记录吸收值。同时测量流液的pH值，其结果如图1、2。

图1 木质素溶液加入Na2CO3-酒石酸钠量-pH吸收值变化曲线图Fig.1 Additation of lignin solution in sodium carbonatesodium tartrate-pH curve

图2 丹宁溶液加入Na2CO3-酒石酸钠量-pH吸收值变化曲线图Fig.2 Additation of tannins solution in sodium carbonatesodium tartrate-pH curve

从图2可以看出，Na2CO3-酒石酸钠溶液取7.5mL较为适宜，pH值在10左右较为稳定，同时吸收值也较大。

2.1.5 两种分析试剂的比较取2mL Folin-Denis试剂，加入10mL饱和Na2CO3溶液。取1mL Folin-Cioc alteu试剂，加入7.5mLNa2CO3-酒石酸钠溶液。两种试剂对标准的木质素和丹宁分析结果见表1、2。

表1 木质素吸收值表Tab.1 Recorvery ratio of lignin

表2 丹宁吸收值表Tab.2 Recorvery ratio of tannins

从表1、2吸收值的数据明显地看出，Folin-Ciocalteu比Folin-Denis试剂灵敏。

2.1.6 丹宁和木质素的回收率 取嫩江水样50mL，分别加入不同量标准的木质素和丹宁溶液，并以嫩江水作空白，测定木质素和丹宁的吸收值、回收率，结果见表3。

表3 木质素和丹宁测定比较表Tab.3 Comparison of lignin and tannins determination

从表3中可以看出，在测定的范围内Folin-Ciocalteu试剂对丹宁的回收率都在93%以上，而木质素较丹宁回收率低。

2.2 丹宁和木质素标准曲线的绘制

分别取配制好的木质素和丹宁的标准溶液（浓度为0.01mg·mL-1）由0.5mL到10mL，放入100mL容量瓶里，加入1mL Folin-Ciocalteu试剂，静止5min，再加入Na2CO3-酒石酸钠溶液7.5mL，用蒸馏水稀释至刻度，溶液逐渐呈现蓝色。以蒸馏水作空白，30min后，在700nm处测定其吸收值，然后绘制标准曲线，如图3、4。

图3 木质素标准曲线Fig.3 Standard curve of lignin

图4 丹宁标准曲线Fig.4 Standard curve of tannin

通过线性拟合得到丹宁标准曲线的方程为：A=0.00896C-0.0000132，相关系数为：r=0.99993。

通过线性拟合得到木质素标准曲线的方程为：A=0.00408C-0.0000244，相关系数为：r=0.99978。

2.3 紫外分光光度法对木质素和丹宁测定的初步考查

由于木质素和丹宁有较强的紫外吸收作用，因此，测定天然水中木质素和丹宁的紫外分光光度计颇多。文献报道有不同的波长（205~230nm、254~280nm、260~280nm），最灵敏的为1mg·L-1。

同时，此外分光光度法也存在许多干扰问题，针对天然水样所含干扰物的不同（硫化物、亚硫酸盐、亚硝酸盐、多种金属离子、酚类和硫醇等）采用的分离方法亦不相同。

实验得到丹宁在0.05~2.5mg·L-1、木质素从0.05 ~2.5mg·L-1、波长在275nm处,狭缝为0.5，纸速2× 20，都呈线性关系。

3 结论

（1）Folin-Denis和Folin-Ciocalteu试剂比较结果见表4。

表4 两种试剂试验比较表Tab.4 Comparison of two reagents experiments

（2）用XAD-2填充玻璃柱，调解不同的pH值，可实现对酚类、腐植酸干扰物的分离及无机干扰物，由于硫酸锂、碳酸钠-酒石酸的加入而掩蔽，解决试剂非特异性的问题，从而提高了分析灵敏度。本实验方法最小检出量即0.01mg·L-1的丹宁含量，平均相对标准偏差为4%；本方法不需要富集，可直接测定，方法快速、灵敏、准确，且操作简单快捷，是一种较为实用的检测方法。

［1］王全杰，等.［J］.标准检测，2010，32（23）：26-31.

［2］ 国家环境保护总局《水和废水检测分析方法》编委会.水和废水监测分析方法（第四版）［M］.北京：中国环境科学出版社，2002. 281-288.