白金针菇液体菌种优良菌株选育

2013-03-20赵黎明

食品与机械 2013年6期

冀宏齐斌赵黎明

（1．天津大学管理与经济学部，天津 300072；2．常熟理工学院，江苏常熟 215500）

金针菇（Flammulina velutipes）学名毛柄金钱菌，又称毛柄小火菇、冬菇、构菌、朴菌［1］。属真菌门、担子菌纲、伞菌目、金针菇属。金针菇因其菌柄细长，似金针菜，故称金针菇，以其菌盖滑嫩、柄脆、营养丰富、味美适口而深受大众喜爱，常用作凉拌菜和火锅的上好食材。除具有很高的营养价值外还兼具药用食疗价值，研究［2－6］发现金针菇多糖有很强的免疫调节和抗肿瘤活性。

按子实体的色泽可将金针菇分为黄色品系、浅黄色品系和白色品系。白色品系菌盖、菌柄纯白色，绒毛少或无［7］，白色品系是金针菇工厂化生产主要品种［8，9］。目前，中国白金针菇工厂化生产普遍使用固体菌种技术，存在制种周期长、隐性污染几率大、菌龄不齐难以标准化管理等弊端。兴起21世纪初的液体菌种技术可为改变现状、实现突破提供可行的技术方案。与固体菌种相比，液体菌种具有生产周期短、菌种纯度高、接种后萌发生长迅速、菌丝体活力旺盛、使用成本低等明显优势，尤其适合大规模工厂化应用，性状优良的液体菌种要求发酵生物量高、菌丝球直径较小、密度较大、生长活力旺盛［10，11］。同工酶分析作为分子遗传标记技术之一，不仅被广泛应用于动植物的遗传分析、生理生化研究，而且被作为化学分类的重要指标应用于真菌的分类鉴定中，是菌株分类鉴定和亲缘关系研究的重要手段，广泛应用于食用菌菌种鉴定及遗传学研究［12，13］，关于同工酶在大型真菌分类鉴定中成功应用已有报道［14－16］。

本试验收集了6株中国白金针菇产区的主要生产菌种，通过观测和比较发酵菌丝体生物量、菌丝球直径、密度及其生长活力等指标，综合确定适合制备液体菌种的白金针菇优良菌株，旨在为工厂化生产白金针菇的液体菌种制备提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

1．1．1 供试菌株

试验用斜面菌种（表1）：由常熟理工学院食用菌工程技术实验室转接并保藏。

表1 金针菇菌株编号Table1 The number of Flammulina velutipes strains

1．1．2 主要试剂

维生素B1、过硫酸铵、蔗糖、Tris、TEMED、Acr、Bis、甘氨酸、乙酸－1－萘酯、乙酸－2－萘酯、固兰RR 盐、丙酮、溴酚蓝、石英砂等：分析纯，中国医药集团上海化学试剂有限公司；

黄豆粉、玉米粉、马铃薯等：市购。

酯酶同工酶电泳的试剂：本实验室参照文献［13］自制。

1．1．3 培养基配方

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯20g，葡萄糖2g，琼脂2g，自来水100mL，pH 自然；

液体培养基：葡萄糖2g／100mL，玉米粉2．5g，黄豆粉1g，磷酸二氢钾0．1g，硫酸镁0．5g，维生素B15mg，自来水100mL，pH 自然。

1．2 仪器与设备

电子天平：M124A 型，伯拉莫贝林（上海）精密仪器有限公司；

便携式（数显）pH 计：FE20型，梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；

超净工作台：CJ－2S型，天津泰斯特仪器有限公司；

振荡培养箱：ZQWY－200G 型，上海知楚仪器有限公司；

人工气候箱：PQX－280A－22HM 型，宁波莱福科技有限公司；

高速冷冻离心机：Centrifuge 5418R 型，德国Eppendorf公司；

移液枪：100－1000型，Eppengorf中国有限公司；

垂直板电泳槽：DYCZ－24DN 型，北京六一仪器公司；

电泳仪：DYY－6C型，北京六一仪器。

1．3 方法

1．3．1 金针菇的液体培养按1．1．3配方配制培养基，灭菌结束后先冷却再接种，以免培养基过烫杀死菌种；活化后的金针菇菌种从冰箱中拿出后要先置于25 ℃下复活2h左右，再无菌接种0．5cm×0．5cm 的菌种块（10d菌龄）于摇瓶内，注意尽量使菌块漂浮在液面上，每瓶接种2块；25℃下静置培养24h后，置于25 ℃恒温振荡培养12d［14］，摇床转速180r／min。

1．3．2 金针菇液体菌种优良菌株的筛选

（1）菌丝球直径的测定：随机取菌球20个，将其排成一条直线，测其总长度，重复3次，取平均值［15］记为D，菌丝球直径即d ＝D／20。

（2）菌丝球数量的测定：取10 mL 的发酵液，80目标准筛过滤，然后计数，此数值记为n 个。100mL 发酵液中菌丝球数目为N ＝10×n。

（3）菌丝体干重的测定：取10 mL 发酵醪液于80目标准筛过滤，用蒸馏水反复冲洗3次，将过滤所得的菌丝体于60 ℃数显电热鼓风干燥箱中烘干至恒重，用分析天平称重，得到金针菇菌丝体细胞干重（md）［17］记为w，100 mL 发酵液中菌丝体的干重为W ＝10×w。

（4）活力值的测定：回接过程在超净工作台上进行，从培养12d的摇瓶中取直径差不多大的菌丝球接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上，菌种尽量接种到平皿中央，每个菌种做3个平行，并重复3次。置于25 ℃恒温培养箱中培养，待菌丝在培养基表面开始生长，从第4天至第7天每隔24h用十字交叉法测定一次菌落直径，计算菌丝体日均生长速度，同时观察记载菌丝长势，即菌丝浓密程度及色泽等［17］。

菌丝体日均生长速度按式（1）计算：

1．3．3 拮抗试验取直径90mm 的平皿，无菌条件下倒入PDA 培养基，待培养基凝固后，在同一PDA 平板上接种2个不同的菌种（两点拮抗），两两接种块之间间距1．5～2．0cm，25 ℃下恒温培养，每天进行观察，有染菌的平皿要及时清理以免污染未染菌的平皿，并记录试验结果。

1．3．4 酯酶同工酶谱分析酯酶同工酶电泳方法参照文献［18－21］。

观察样品酶带的位置，按式（2）计算每条酶带的Rf值：

式中：

Rfn—— 条带n 的迁移率；

dn—— 条带n 的迁移距离，cm；

d—— 溴酚兰的迁移距离，cm。

相似性判断公式（3）：

式中：

Se—— 被检样品和标准样品二者间相似系数；

Sxy—— 被检样品和标准样品二者间共有酶带数；

Sx—— 标准样品特有酶带数；

Sy—— 被检样品特有酶带数。

2 结果与分析

2．1 金针菇品种之间的拮抗试验

拮抗试验是用来检测地域差异较大菌株的方法之一，两菌种之间的拮抗线越明显，说明这两个菌种之间的地域差异越大，亲缘关系越远。通过两点拮抗试验观察（图1）得到的试验结果见表2。

图1 拮抗试验部分照片Figure1 The picture of antagonistic experiments

表2 金针菇品种间的拮抗试验Table2 Antagonistic experiments Result of Flammulina velutipes

由图1和表2可知，除品种2和品种3、品种1和品种4、品种6和品种4外，其余平皿中间均有明显的拮抗线，说明其余品种之间的地域差异较大；而品种2和品种3、品种1和品种4、品种6和品种4之间的拮抗线不明显，但拮抗线依然存在，说明这两个品种之间的地域差异较小，亲缘关系较近。

2．2 不同品种金针菇的酯酶同工酶谱的分析

酯酶同工酶电泳图谱中谱酶带的位置是由编码各酶带的基因直接决定的，所以从酶带的位置可知道此6个品种金针菇的基因型是否有差异；同时，酶带宽度和颜色深浅可表明酶的活性和含量［14］，同样可作为判断遗传差异的依据。图2是6个品种金针菇的酯酶同工酶谱鉴定结果，图3中数据代表Rf值。

图2 6个品种金针菇的酯酶同工酶图谱Figure2 The result of esterase isoenzyme electrophoresis in 6varieties

图3 6个品种金针菇的酯酶同工酶模式图Figure3 The schema chart of esterase isoenzyme electrophoresis in 6varieties

各品种金针菇酶带的迁移率见表3。由表3可知，有些菌株间酶谱差异较小，酶带数相同，酶谱相似，而有些菌株间酶谱差异较大。其中有4条是6个品种均有的酶带，可认为这4条酶带是金针菇的基础酶带，个别菌株有其特征酶带［21］。

表3 6个品种金针菇的酯酶同工酶条带的迁移率Table3 The mobility comparison of esterase isoenzyme band in 6varietise

根据式（2）和（3）可计算出各品种之间的相似系数Se，相似系数表明了两者之间的亲缘关系。由表4可知，品种2和品种3、品种4和品种6之间的相似系数分别为0．923和0．933，从酶谱上（图2和3）也可看出两品种之间在酶带数量和表达位置上只有1条谱带之差，这说明了两者遗传基础非常相似。其余品种之间的相似系数在0．667～0．857，表明两品种之间的遗传基础有差异［22］。

表4 6个品种金针菇的酯酶同工酶的相似系数Table4 The similarity coefficient of esterase isoenzyme in 6varietise

酯酶同工酶谱分析得出的结论与拮抗试验的结果基本吻合，说明6个品种之间存在或远或近的亲缘关系。

2．3 不同品种金针菇液体发酵的性状

为筛选出适合液体发酵的品种，将发酵培养出的金针菇菌丝球的直径、密度和干重作为筛选依据，不同品种金针菇液体发酵的性状见表5。

表5 金针菇液体发酵菌株的性状Table5 The screening basis of predominant strain of Flammulina velutipesin liquid culture（n ＝10）

由表5可知，各品种干重由大到小为品种6＞品种3＞品种2＞品种5＞品种1＞品种4。其中品种3和品种6的干重最大，分别为1．628g／100 mL 和1．662g／100 mL。液体发酵中干重∶湿重≈1∶9，干重约达到1．6g／100 mL，说明100mL培养基能培养出至少14．4g（鲜重）菌丝球。可初步判断品种3和品种6较适合进行液体发酵。

对于液体发酵的菌丝球直径一般要求在0．2cm 左右，6个品种菌丝体直径由大至小依次为品种5＞品种6＞品种2＞品种1＞品种4＞品种3，除品种5外，其余5个品种的直径都在0．2cm 左右，差别不大。重点研究品种3和6可发现，品种3的直径是最接近要求。

对于液体发酵的菌丝球密度要求在3 000个／100mL左右，达到此要求的只有品种3，菌丝球密度由大至小依次为品种3＞品种4＞品种1＞品种6＞品种5＞品种2。品种2和5菌丝球密度分别为2 079，2 216个／100mL，除与所要求的3 000 个／100 mL 差别较大外，与其余4 个品种的差别也较大。

综上所述，品种3的菌丝体直径最小仅为0．203cm，且密度最大可达到3 045个／100mL、干重1．628g／100mL，是本试验筛选出的优势菌株；而品种6 的菌丝体直径0．233cm、密度2 631个／100 mL、干重1．662g／100 mL，是本试验筛选出的较优菌株。

2．4 不同品种金针菇菌株活力值

将发酵好的液体菌丝球回接到固体培养基上进行培养，以测定菌株活力值。本试验测定了6个品种金针菇接种至平板后第4～7天的菌落半径，并计算出日均生长速度，结果见表6。

表6 不同品种金针菇菌株菌丝体的生长情况Table6 The result of mycelial growth in six Flammulina velutipes（n ＝3）

由表6可知，6个品种生长速度由快到慢依次为品种2＞品种1＞品种6＞品种4＞品种5＞品种3。除了生长最快的品种2（生长速度0．535cm／d）和生长最慢的品种3（生长速度0．349cm／d）外，其余4个品种的平均生长速度差别不大。结合2．3得出的结论，可筛选出白金针菇液体发酵的优势菌株为品种6，即河北金针菇。

3 结论

（1）本试验筛选出了既适合液体发酵培养又能够工厂化栽培高产的白金针菇优良菌株。通过液体发酵技术筛选出优势菌株为日本白金金针菇和河北金针菇；再通过液体发酵菌丝球回接生长速度比较试验确定河北金针菇为液体菌种优良菌株。

（2）酯酶同工酶电泳的鉴别方法和拮抗试验都是鉴定菌种亲缘关系的方法，但酯酶同工酶电泳准确度更高，表现出的信息也更多，后续试验还可运用分子生物学手段进一步分析确定6个品种金针菇之间的遗传关系。

（3）通过菌丝体回接试验确定菌株活力值的方法还不够完善，尚需进行工厂化出菇试验才能准确测定液体菌种的生产性能。

1 王文亮，徐同成，刘丽娜，等．金针菇的保健功能及其开发前景［J］．中国食物与营养，2011，17（7）：18～19．

2 Ikekawa T，Ikeda Y，Yoshioka Y．The structure of EA3and further purification of EA5［J］．J．Pharm Dyn．，1982（5）：576～581．

3 曾庆田．金针菇多糖的抗肿瘤作用［J］．中国食用菌，1991，10（2）：11～13．

4 Gong F，Chen Y，Gong Y，et al．Crystallization and some characteriza－tion of Flammulin purified from the fruit bodies of Flammulinavelutipes［J］．Bioresource Technology，1998，64（2）：153～156．

5 Leung M，Fung K，Choy Y．The isolation and characterization of an immunomodulatory and antitumor polysaccharide preparation fromFlammulina velutipes［J］．Immunopharmacology，1997，35（3）：255～263．

6 严茂祥，陈芝芸，项柏康，等．金针菇多糖对小鼠移植性肿瘤抗瘤效应研究［J］．中国中医药科技，1996，6（6）：379～380．

7 吕作舟．食用菌栽培学［M］．北京：高等教育出版社，2011：200～212．

8 沈秀荣．金针菇FV908 菌株液体培养工艺的研究［J］．微生物学杂志，2002（1）：18～19．

9 马瑞霞，姚献华，魏志华，等．白色金针菇液体菌种生产技术研究［J］．中国食用菌，2005，24（6）：16～17．

10 王谦，刘玉霞，刘会欣，等．金针菇的深层液体培养及应用［J］．湖北农业科学，2006，45（1）：84～85．

11 王洪波，赵从凯，郝会军，等．金针菇液体发酵条件初探［J］．安徽农业科学，2009，37（1）：40～41．

12 刘祖同，罗信昌．食用蕈菌生物技术及应用［M］．北京：清华大学出版社，2002．

13 中华人民共和国农业行业标准．NY／T 1097－2006 食用菌菌种真实性鉴定酯酶同工酶电泳法［S］．北京：中国农业出版社，2006．

14 张长青，王红英，张建民，等．适宜白灵菇菌丝生长条件的研究［J］．特产研究，2003（4）：12～14，18．

15 Royse D J，May B．Use of isozyme variation to identify genotypic classes of Agaricus brunnescens［J］．Mycologia，1982，74（1）：93～102．

16 Royse D J，May B．Genetic relatedness and its application in selective breeding of Agaricus brunnescens［J］．Mycologia，1982，74（4）：569～575．

17 王稳，朱忠贵，李萍萍．八个金针菇菌株液体培养与应用效果初报［J］．食用菌，2005，27（3）：18～19．