产广谱细菌素乳酸菌的筛选及分类鉴定

滕志利 钱 方 姜淑娟 牟光庆

（大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034）

食品在加工与储藏过程中，都不可避免会受到环境中微生物的污染，而引起腐败变质，长期以来，食品工业都习惯于使用化学合成防腐剂，这些防腐剂对人体有一定的毒副作用［1］。乳酸菌素是由乳酸菌产生的一种具有活性的多肽或蛋白质，对人体完全无毒副作用，而且能够被人体吸收，其应用前景越来越受到人们的关注［2］。中国对乳酸菌素的研究起步相对较晚，Nisin是目前研究最深入的乳酸菌素，但是Nisin的抑菌谱比较狭窄，所以其应用范围受到了一定的限制［3］。本研究旨在筛选出产广谱细菌素（既抑制革兰氏阴性菌又抑制革兰氏阳性菌）的乳酸菌菌株，并对其进行分类鉴定。

1 材料与方法

1．1 材料与仪器

1．1．1 采集样品

泡菜、酸菜、酸奶、奶酪：市售。

1．1．2 指示菌

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌：本实验室保存。

1．1．3 培养基

MRS培养基：蛋白胨1．0g、牛肉膏1．0g、酵母膏0．5g、K2HPO40．2g、柠檬酸二铵0．2g、乙酸钠0．2g、葡萄糖2．0g、吐温80 0．1mL、MgSO4·7H2O 0．058g、MnSO4·4H2O 0．025g、琼脂1．5g，pH 6．8，蒸馏水100mL；

肉汤培养基：蛋白胨1．0g、牛肉膏0．3g、氯化钠0．5g，pH 7．2，蒸馏水100mL；

分离培养基：蛋白胨1．0g、牛肉膏1．0g、酵母膏0．5g、K2HPO40．2g、柠檬酸二铵0．2g、乙酸钠0．2g、葡萄糖2．0g、吐温80 0．1 mL、MgSO4·7H2O 0．058g、MnSO4·4H2O 0．025g、碳酸钙0．5g、1．6%的溴甲酚绿乙醇溶液0．14mL、琼脂1．5g，pH 6．5，蒸馏水100mL；

营养琼脂培养基：蛋白胨1．0g、牛肉膏0．3g、氯化钠0．5g、琼脂1．7g，pH 7．2，蒸馏水100mL［4］。

1．1．4 主要仪器与设备

恒温磁力搅拌器：85－2型，巩义市英峪予华仪器厂；

冷冻高速离心机：3－18K 型，德国Sigma公司；

精密pH 计：PHS－3C型，上海雷磁仪器厂；

手提式不锈钢蒸汽消毒器：YX280A 型，上海三申医疗仪器有限公司。

1．2 方法

1．2．1 乳酸菌的分离 将泡菜汁（A）、酸菜汁（B）、酸奶（C）、奶酪汁液（D）各取1mL 左右加入到盛有9 mL 无菌生理盐水试管中，连续10 倍递增稀释，取10－4，10－5，10－6稀释液200μL，分别涂布于含有溴甲酚绿酒精溶液和碳酸钙的MRS平板上，37℃培养48h。挑取钙溶圈较大、培养基变黄的菌落，用平板划线法在MRS平板上反复划线分离，直至革兰氏染色观察中菌株颜色、大小、形态一致，选择单菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验。将革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性菌株划线接种到MRS 斜面培养，4 ℃冰箱保存备用［5－7］。

1．2．2 产广谱细菌素乳酸菌的初筛

（1）发酵上清液的制备：用接种环挑取活化的乳酸菌接种于MRS液体培养基中37 ℃培养48h，10 000r／min离心15min除去菌体，得到上清液。

（2）指示菌的培养和菌悬液的制备：将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌采用肉汤培养基，于37 ℃、160r／min摇床培养24h，通过倾注培养法测得两种指示菌的菌液浓度，用无菌生理盐水分别将它们稀释成浓度为106个／mL 的菌悬液，4 ℃冰箱保存待用。

（3）抑菌试验：采用牛津杯双层琼脂扩散法［8，9］。在已灭菌的平皿中倒入15mL 加热融化的琼脂（2%），完全凝固后，等距离放入灭菌牛津杯数个。将分装于锥形瓶中的20mL营养琼脂培养基融化后冷却至55 ℃左右，加入浓度为106个／mL指示菌菌悬液300μL，迅速混合均匀，倒入平皿。冷却后，移去牛津杯，作为乳酸菌素活性检测平板。取150μL乳酸菌发酵上清液，以无菌操作加入到检测平板圆孔内，同时做3组平行。37℃培养18h，量取抑菌圈直径，选取小孔周围有明显抑菌圈的菌株待用。

1．2．3 产广谱细菌素乳酸菌的复筛

（1）酸排除试验：取pH 4．5作为无乳酸抑制作用的最小pH，用l mol／L NaOH 和1 mol／L HCl调节初筛菌株的发酵上清液pH 至4．5，以相应pH 值的MRS液体培养基为对照，然后进行抑菌试验，同时做3组平行。37℃培养18h，量取抑菌圈直径［10］。

（2）过氧化氢排除试验：挑取排除酸作用后仍具有较强抑菌效果的菌株，将其发酵上清液于80 ℃加热10 min后，进行抑菌试验，同时做3组平行。37 ℃培养18h，量取抑菌圈直径［10］。

（3）蛋白酶敏感性试验：挑取排除酸、过氧化氢干扰后抑菌活性最强的菌株进行蛋白酶敏感性试验，将此菌株的发酵上清液的pH 值调到胰蛋白酶、木瓜蛋白酶作用的最适pH 值7．0，按终浓度为1 mg／mL 加入各酶，37 ℃温育2h，将pH 值调到4．5后进行抑菌试验，同时做3组平行。37 ℃培养18h，量取抑菌圈直径［10］。

1．2．4 产广谱细菌素乳酸菌的分类鉴定 按照图1的鉴定程序区分不同的乳酸菌菌属，并通过个体形态和菌落特征、生理生化特性等对种进行鉴定。

图1 乳酸菌属鉴定程序［4，11］ Figure1 Identification procedure of Lactobacillus

2 结果与分析

2．1 乳酸菌的分离

从多种样品中共筛选出30株乳酸菌，其中从泡菜中分离出17株、酸菜汁中7株、酸奶中4株、奶酪中2株。它们的菌落为乳白色或略显黄色，光滑、湿润，边缘整齐，菌落凸起，革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性，菌落周围的钙溶圈较大，且能使含有溴甲酚绿酒精的MRS培养基变成黄色，这些都符合乳酸菌的特征。

2．2 产广谱细菌素乳酸菌的初筛

从30株乳酸菌中筛选出8株对两种指示菌均有较强抑制作用的菌株，它们分别来源于泡菜（A）、酸菜汁（B），编号分别为A1、A5、A8、A9、A10、A13、B1、B5，抑菌结果见图2。由图2可知，所筛选出的8株乳酸菌的发酵产物对大肠杆菌的抑菌效果好于金黄色葡萄球菌。乳酸菌素的抑菌谱普遍较窄，一般仅对有亲缘关系的种有抑制作用，所以此次筛选出的乳酸菌菌株具有广谱抑菌作用，既抑制革兰氏阳性菌，又抑制革兰氏阴性菌。

2．3 产广谱细菌素乳酸菌的复筛

2．3．1 酸排除试验 乳酸菌发酵上清液对指示菌的抑制作用可能是乙酸、乳酸等某些有机酸作用，也可能是代谢合成的细菌素引起的，当pH 值为4．5时，可排除有机酸的干扰，调节试验筛选菌株发酵上清液的pH 为4．5 后进行抑菌试验。指示菌经过18h培养后观察（见图3），对照孔（pH 为4．5的MRS液体培养基）周围没有出现抑菌圈，而8株菌中仍有5株菌对指示菌有一定抑制作用，说明这5株菌的发酵上清液中除有机酸外还存在其它抑菌活性物质。

图2 初筛乳酸菌抑菌活性Figure2 The inhibitory activity of preliminary screening lactic acid bacteia

图3 各菌株发酵上清液的抑菌活性（pH 4．5）Figure3 The inhibitory activity of fermented supernatant for several bacterial strain

2．3．2 过氧化氢排除试验 乳酸菌在代谢过程中产生的过氧化氢也可能抑制微生物的生长，故将上述5株菌的发酵上清液经80 ℃加热处理10min，使过氧化氢充分分解，冷却后进行抑菌试验。抑菌结果表明（图4），只有乳酸菌A5和A9的发酵上清液对两种指示菌的抑菌活性变化较大，由此可知，乳酸菌A1、A8、B1的发酵上清液抑菌效果不是过氧化氢的作用，可能含有其它抑菌物质。

2．3．3 蛋白酶敏感性试验 从乳酸菌A1、A8、B1中挑取抑菌作用最强的乳酸菌A8进行酶解试验，按终浓度为1mg／mL将胰蛋白酶、木瓜蛋白酶加入到乳酸菌A8的发酵上清液中，然后进行抑菌试验。由表1可知，乳酸菌A8的发酵上清液经胰蛋白酶、木瓜蛋白酶作用后，对两种指示菌的抑菌活性完全丧失，表明此抑菌物质是一类细菌素。

图4 各菌株发酵上清液的抑菌活性（80 ℃、10min）Figure4 The inhibitory activity of fermented supernatant for several bacterial strain

表1 乳酸菌A8 的发酵上清液蛋白酶敏感性试验Table1 The susceptibility of fermented supernatant for Lactic acid bacteria A8to protease ／mm

2．4 产广谱细菌素乳酸菌A8 的分类鉴定

2．4．1 个体形态和菌落特征 由图5、6可知，筛选乳酸菌A8，其菌体细胞呈杆状，单个、成对或成链状排列，革兰氏染色呈阳性，无芽孢；菌落表面光滑、边缘整齐、乳白色不透明，这与乳杆菌较相似。

2．4．2 生理生化特性 乳酸菌A8的生理生化特性结果见表2。过氧化氢试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、明胶液化试验均呈阴性，不产硫化氢，pH 4．5能生长，乳酸菌A8符合乳杆菌属的生物学特性（图1）。同时它能够发酵果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、甘露醇、棉籽糖、山梨醇，不能发酵阿拉伯糖和木糖，参照文献［4］可知，乳酸菌A8的糖

图5 乳酸菌A8 的菌落特征Figure5 The colony of Lactic acid bacteria A8

图6 乳酸菌A8 倍的菌体形态（10×100）Figure6 The thallus of Lactic acid bacteria A8

表2 乳酸菌A8 的生理生化特性Table2 Physiological and biochemical characteristics of Lactic acid bacteria A8

类发酵特性与植物乳杆菌（L．plantarum）、戊糖乳杆菌（L．pentosus）等菌株比较相似。

综上，它与植物乳杆菌（L．plantarum）个体形态、菌落特征和生理生化特性基本相同，确定乳酸菌A8为植物乳杆菌，将其命名为Lactobacillus plantarum A8。

3 结论

本研究从多种样品中筛选出30株乳酸菌，排除发酵上清液中有机酸、过氧化氢的影响后筛选得到1株分离自泡菜的具有较强抑菌活性的乳酸菌A8；通过蛋白酶敏感性试验确定该菌株所产抑菌物质为具有蛋白质性质的细菌素，结合生理生化特性和形态学观察，初步确定乳酸菌A8为植物乳杆菌（L．plantarum）。 目前，细菌素大多仅仅抑制同种的或亲缘关系较近的细菌，而植物乳杆菌A8所产细菌素的抑菌谱较广，并且对人体安全无毒，能够被消化系统的蛋白酶分解成各种氨基酸而被人体吸收，所以它作为一种天然、高效、安全的新型防腐剂，有着广阔的应用前景。

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