布鲁菌致病特点和疫苗的研究新进展

白旭华，吕昌龙

(1.内蒙古民族大学医学院微生物学与免疫学教研室，内蒙古通辽 028000;2.中国医科大学免疫研究所，辽宁沈阳 110001)

布鲁菌病(Brucellosis)简称布病，是由布鲁菌(Brucella)引起的一种人畜共患的传染性疾病。布鲁菌是一种革兰阴性菌，有粗糙型和光滑型2种，能够在细胞内寄生，感染家畜引起流产和不孕，造成大量的经济损失，还能引起人的波状热、心内膜炎、关节炎和骨髓炎等［1］。布鲁菌属细菌大多数种型对人畜是有致病性的，对人畜皆有致病作用的是羊种菌(B.melitensis)、牛种菌(B.abortus)、猪种菌(B.suis)和犬种菌(B.canis)，对畜有致病对人无致病的有绵羊附睾种(B.ovis)，对人畜皆无致病的是林鼠布鲁菌(B.neotomae)。布鲁菌抗原的主要成分是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和高度特异的外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)。LPS包含3种成分:O多糖抗原、核心多糖和类脂A。光滑型较粗糙型多含O链脂多糖。布鲁菌致病毒力因子是LPS、OMP及其他毒力相关因子。毒力相关因子包括过氧化氢酶、尿素酶、cu/zn超氧岐化酶、RecA重组调节基因、groE生长基因、HtrA耐高温基因和ErY基因等。

1 布鲁菌致病特点及其机制

布鲁菌感染宿主细胞后，宿主细胞通过模式识别受体(pattern recognize receptor，PRR)识别病原体的某些高度保守分子结构，即病原相关分子模式(pathogen-associated molecule pattern)，激活固有免疫和适应性免疫应答。已经证明的PRR有Toll样受体(TLRs)、核苷酸结合寡聚化作用域样受体(nucleotide binding and oligomerization domain-like receptors)和视黄酸诱导基因1-样受体(retinoic acid-inducible gene 1-like receptors)。在抗布鲁菌的适应性免疫中有2种机制发挥重要作用，一是CD4+T细胞、CD8+T细胞和γδ T细胞产生的IFN-γ激活巨噬细胞，抑制布鲁菌在吞噬细胞内的生存复制;二是CD8+T细胞和γδ T细胞致布鲁菌感染的靶细胞裂解破坏。布鲁菌最突出的致病特点是干扰宿主细胞发挥固有免疫和适应性免疫应答。布鲁菌通过减少、修饰或隐藏病原相关分子模式(如LPS)的方式，经由脂筏进入巨噬细胞吞噬体后，与内质网融合，获得部分内质网膜形成含布鲁菌空泡(Brucella-containing vacuole，BCV)，实现胞内生存复制，从而逃避适应性免疫应答的激活和产生［2］。

1.1 布鲁菌的非典型LPS结构

布鲁菌表面缺乏能激活固有免疫应答的结构，如荚膜、菌毛和纤毛等。布鲁菌的显著特点是含有非典型的LPS结构。与其他革兰阴性菌相比，布鲁菌的类脂A含有双氨基葡糖骨架，而不是葡糖胺和酰基结构。此种类脂A易诱发的是弱而且持续性的炎性应答［3］。LPS的O抗原可降低巨噬细胞的活性，致使布鲁菌不能被有效杀伤;O抗原还能与MHCⅡ类分子结合成复合物，抑制巨噬细胞对布鲁菌蛋白质抗原的提呈，也就不能为T细胞的激活提供信号。Barrionuevo等［4］研究证实热灭活的布鲁菌或脂蛋白能够下调抗原提呈细胞表达MHCⅡ分子，这个过程具有TLR-2依赖性，并且由IL-6介导。

1.2 布鲁菌在布氏小体内大量复制

布鲁菌LPS以外的其它因素也可使细菌进入吞噬细胞，不能激活有效的抗菌机制。布鲁菌通过脂筏进入巨噬细胞形成的BCV，与内质网(endoplasmic reticulum)膜融合，形成布鲁菌在吞噬细胞内的复制部位;不与溶酶体融合，逃避细菌被溶酶体酶降解［5］。此过程依赖于Ⅳ型分泌系统(typeⅣ secretion system)分泌的分子 VirB。VirB在宿主细胞内可改变布鲁菌的运送途径，使细菌输送到增殖部位。此外，布鲁菌还能够产生周质环状 β-1，2-葡聚糖(periplasmic cyclic β-1，2-glucan)，与巨噬细胞内的胆固醇形成脂筏，诱导运送布鲁菌至BCV。

1.3 布鲁菌的Btp1/TcpB蛋白抑制激活免疫应答

Btp1/TcpB蛋白可通过抑制TLRs介导的免疫应答激活信号通路，导致布鲁菌的体内持续性存活与感染。Sengupta等［6］研究证明布鲁菌Btp1/TcpB蛋白与TLRs中的TIR结构域具有显著同源性。细胞内的MyD88、MAL/TIRAP、TRIF和TRAM等适配器分子也同样含有TIR结构域。Btp1/TcpB蛋白与MAL/TIRAP结合，通过MyD88依赖途径干扰TLR2介导的信号通路，阻止布鲁菌感染的树突状细胞成熟。Btp1/TcpB蛋白还能够导致MAL的多泛素化作用增强，加速MAL的降解过程。深入了解布鲁菌抑制机体免疫应答激活的机制将有助于有效疫苗的研制。

2 布鲁菌新型疫苗的研究进展

2.1 减毒活疫苗

目前，牛种布鲁菌株19(B.abortus strain 19，S19)、羊种布鲁菌株 Rev.1(B.melitensis Rev1，Rev1)和粗糙型牛种布鲁菌株51(rough strain B.abortus 51，RB51)3种减毒活疫苗广泛用于家畜的布鲁菌感染预防，并已取得一定的成效。但S19和Rev1减毒活疫苗仍具有较高毒力，会导致怀孕家畜流产，对人也具有一定的致病性。此外，S19和Rev1菌株的LPS还会干扰布鲁菌病的临床实验诊断。

为克服目前减毒活疫苗存在的缺点，将减轻疫苗毒力和诱导LPS合成相关基因突变作为疫苗的有效研究策略。Barrio等［7］观察了用3种核心和O-多糖缺陷B.melitensis突变株wbkF、per和wa＊＊制备的疫苗，结果发现在小鼠模型中获得了非常理想的保护性效果，但接种羊后其保护率仅为54%，远远低于Rev1疫苗的100%有效率。进一步证明减毒活疫苗刺激机体主要产生抗O-多糖抗体。Lacerda等［8］发现阻止wbkC基因转录，可产生牛型布鲁菌(B.Abortus)粗糙型突变。wbkC基因编码LPS合成相关甲基化转移酶。用该牛型布鲁菌△wbkC突变株感染骨髓来源的巨噬细胞，发现与光滑型比较粗糙型不形成复制龛，能诱导高水平的 IL-12和 TNF-α的产生。在C57BL/6和干扰素调节因子-1(IRF-1)敲出鼠体内均显示弱毒性。

Arenas-Gamboad等［9］将S19的转录调控因子VjbR基因敲出制成突变株，接种小鼠模型发现其编码相关产物virB操纵子和鞭毛基因的表达下调，毒力下降，诱导了高水平抗布鲁菌感染的保护力。Trant等［10］构建了磷酸甘油酸激酶(PGK)基因敲出B.abortus突变株，该突变株在骨髓来源的巨噬细胞和BALB/c、C57BL/6、129/Sv和 IRF-1敲出鼠体内均显示了极低毒性。感染24 h后未发现野毒株感染后形成的含有内质网膜的复制龛。60%以上的BCVs检出内体/溶酶体的标记LAMP1。将此突变株制成活疫苗，接种129/Sv和IRF-1敲出小鼠进行攻击实验，结果显示了远超出S19和RB51减毒疫苗株的免疫保护强度。

上述研究提示对布鲁菌某些毒力基因进行修饰可能会为疫苗的制备带来希望。

2.2 重组蛋白疫苗

重组蛋白疫苗是亚单位疫苗中的一种。布鲁菌细胞表面和胞内的许多蛋白组分已作为保护性抗原进行研究，如Omp31、L7/L12核糖体蛋白、2，4-二氢喋啶合酶(The lumazine synthase)等。Yang等［11］应用基因重组技术制备的S-腺苷高半胱氨酸水解酶(AdoHcyase)接种动物模型，发现此重组蛋白疫苗能够诱导较强的Th1型免疫应答，保护效果与Rev1减毒活疫苗相似。周质结合蛋白39(periplasmic-binding protein 39，P39)与CpG寡核苷酸结合形成重组蛋白疫苗免疫小鼠4周后的保护作用，与减毒活疫苗S19免疫8周后的效果相似，提示重组蛋白疫苗具有巨大潜力。

与减毒活疫苗相比，重组蛋白疫苗具有安全性高、无传染风险、不会转变成致病株等优点，缺点是免疫原性相对较弱，因此需要具有免疫调节作用的佐剂辅助［12］。Denisov 等［13］比较了 larifan、polyoxidonium、natrium thiosulfate、TNF-β 等佐剂的效果，发现 TNF-β作为B.abortus株82-PS佐剂的免疫作用最强。Kaushik等［14］将保护性抗原Omp39与佐剂CpG寡核苷酸序列结合，研制的rOmp39重组蛋白疫苗，接种于小鼠模型显示有中等水平的抗B.abortus作用。

到目前为止虽已报道了 L7/L12、BLS、OMP31、P39、DNAK、SurA、Omp28、CGH、Omp16、Omp19和S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶等多种重组蛋白疫苗具有一定的免疫保护作用，但联合多种抗原蛋白的疫苗并未显示其优越性。其原因可能是不同抗原表位间存在相互干扰［15］。有关Cu-Zn超氧化物歧化酶(Cu-Zn superoxide dismutase，Cu-Zn SOD)重组蛋白疫苗的研究发现，真正具有保护作用的不是Cu-Zn SOD的全部，而是其中的一条肽链。因此，研制重组蛋白疫苗中选择合适的抗原肽进行重组是其关键步骤。此外，Pasquevich等［16-17］首次提出重组蛋白疫苗Omp16和Omp19中的脂蛋白本身具有佐剂的特性，从而避免添加外源性佐剂可能造成的不良反应(如注射部位炎性肉芽肿和无菌脓肿的形成)。为重组蛋白疫苗的研制开辟了另一种思路。

2.3 DNA 疫苗

DNA疫苗指直接把含有目的抗原基因的重组质粒转染或注射到动物细胞中，使之在细胞内持续表达出天然的抗原物质，诱导特异性细胞毒性T细胞(cytolytic T cell，CTL)及Th1型免疫应答。布鲁菌的全基因组测序的完成为研制DNA疫苗提供了完整的抗原基因信息。在布鲁菌感染的小鼠模型中，许多抗原基因已经被作为DNA疫苗进行研制，如外膜蛋白、细菌表面蛋白、核蛋白的基因。

已有的研究显示，含有单一目的基因的DNA疫苗虽具有一定的免疫保护效果，但并不十分理想。应用可表达多种抗原的多价DNA疫苗接种小鼠，发现能够产生更高强度的免疫保护作用，认为其机制可能是多种抗原诱导了IFN-γ分泌、特异性Th1型抗体产生和CD8+CTL活化等不同种类免疫应答的协同作用［18］。Luo等［19］研制的含有L7/L12和Omp16基因的DNA疫苗，证实较含单一基因的DNA疫苗的效果有显著提高，其提高与CD8+CTL活性增强有关。将编码细胞因子的基因与编码可刺激机体产生保护性免疫应答的布鲁菌抗原分子的基因重组制备DNA疫苗，能够诱导强烈免疫应答。疫苗接种后表达的细胞因子可作为佐剂发挥效应。还可通过改变抗原基因的启动子或插入分泌信号序列的方式，使抗原基因更有效表达，提高DNA疫苗的免疫原性和免疫应答刺激作用。

针对DNA疫苗肌肉接种需要较大剂量DNA疫苗的问题，有人提出应用基因枪接种或纳米颗粒技术解决，以便提高DNA疫苗的摄入率和体内存留半衰期延长［20］。已有的研究报道，小鼠模型研究获得有效的布鲁菌DNA疫苗接种于较大动物并非全部获得与小鼠同样的结果，提示相关DNA疫苗的研制尚需进一步改进［21］。DNA疫苗的生物安全性问题，如诱导免疫耐受和自身免疫疾病的产生、基因的稳定性、抗性基因的转移等仍需考虑和进行全面评价。

3 结语

布鲁菌具有非典型的LPS结构，可通过脂筏进入巨噬细胞形成布氏小体，实现胞内生存和复制，导致机体的持续性感染。布鲁菌感染、致病、逃避和抑制机体免疫应答的机制，应作为设计具有特异性保护力的DNA疫苗、重组蛋白疫苗和减毒活疫苗的依据。针对布鲁菌的PRR(如TLRs)研制其激动剂作为佐剂，会有效活化抗原提呈细胞提呈抗原，减弱免疫耐受性，刺激机体固有和适应性免疫应答［22］。此外，纳米微粒技术研制疫苗的引入，还可能保护所承载的抗原免受各种酶的降解，延长免疫应答的时间，增强抗原达到黏膜相关淋巴组织的效率，诱导记忆细胞的产生，实现产生持久保护性免疫的目标［23］。

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