蛋氨酸脑啡肽—阿片受体激活免疫细胞抗肿瘤活性的研究进展

陈 取，赵力挽，单风平

(1.中国医科大学临床医学七年制，辽宁沈阳 110001;2.中国医科大学临床医学五年制，辽宁沈阳 110001;3.中国医科大学免疫学教研室，辽宁沈阳 110001)

蛋氨酸脑啡肽(Methionine enkephalin，MENK)是一种由5个氨基酸组成的五肽类物质。人们在对MENK的临床研究中发现了其对于神经内分泌以及免疫系统的调节活性，除此之外MENK对于肿瘤细胞的生长也起到了抑制作用。作为一种重要的免疫调节信号分子，MENK通过结合在阿片受体(主要是δ-阿片受体)，从而对于树突状细胞，自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞等一系列的免疫细胞起到调节作用，例如提高鼠脾细胞数量的增殖以及 IL-2、IL-4、IFN-γ的分泌［1-2］。MENK的上述作用主要通过存在于细胞表面的阿片受体，激活其下游一系列的通路和蛋白激酶，从而实现对于靶细胞形态与功能的调节，而这其中又以调节树突状细胞 (DC Dendritic cells，DC)的意义最为重大。树突状细胞是人体内的一种抗原呈递细胞(Antigen presenting cell，APC)，同时也是抗原呈递能力最强的APC［3］。作为机体免疫应答的重要参与者，DC对于机体免疫中B细胞与T细胞的免疫反应至关重要。主要表现在DC能够通过表达CD80与CD86等共同刺激分子，以及干扰素-α和IL-12等细胞因子，参与到B细胞与T细胞的征集、扩增与维持。

1 蛋氨酸脑啡肽激活免疫细胞的机制

1.1 MENK与阿片受体

MENK通过与免疫细胞上的阿片受体相结合发挥免疫调节作用。研究表明，能够与MENK结合的阿片受体广泛存在于免疫系统的淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞中。在人、鼠的DC细胞表面存在大量的阿片受体［4-6］。MENK通过与这些细胞表面的阿片受体作用，双向调控胞内cAMP-蛋白激酶 A(cAMP-PKA)、Ca2+-钙调蛋白、蛋白激酶C(PKC)的水平。这些物质作为细胞内信号通路的重要组成者，参与到下游基因的表达与调控。

1.2 cAMP-PKA信号通路与免疫细胞

MENK能够下调cAMP-PKA信号通路的表达［7］，参与到DC内细胞因子的产生，以及 DC自身的成熟与抗原提呈能力的发挥等过程中。Oliveira CJ等［8］通过研究红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus)的唾液，发现该物质能够发挥抑制DC中细胞因子合成的作用，而且该物质的作用机制类似于前列腺素E2(PGE2)，即通过诱导DC细胞内cAMP-PKA信号通路的表达，以及抑制成熟DC表达CD40而发挥作用。

进一步的研究发现［9-11］，PGE2，cAMP-PKA 对于骨髓源性DC的抑制作用，主要是借助存在于DC细胞膜上的激酶锚定蛋白(A-kinase anchoring proteins，AKAPs)而发挥的。AKAPs主要分布在细胞膜的磷脂筏中［10］，通过使用 AKAPs的抑制性多肽，如 Ht31与 AKAP-IS，并借助测定 CD4(+)T细胞分泌的干扰素-γ来间接判断DC细胞功能，研究人员发现抗原的提呈能力下降了30%～50%［9］，但其下游机制尚不清楚。此外，PGE2通过调高cAMP-PKA信号通路表达的方式［11］，最终下调了DC细胞内IL-12等关键性细胞因子的分泌，起到了拮抗DC在局部炎症中的破坏作用。综上所述，PGE2通过一种依赖cAMP-PKA的途径，而实现对下游AKAPs的调节，从而一同参与了抑制DC的抗原提呈、细胞因子分泌、以及DC本身的成熟的整个过程之中，但其具体机制尚不明确，文献报道极少。而对DC使用MENK，通过抑制前述中的cAMP-PKA信号通路，有效地拮抗了前述机制对于DC的抑制作用，达到了调高DC活性的作用。

1.3 Ca2+-钙调蛋白与免疫细胞

MENK通过激活阿片受体起到了提高Ca2+-钙调蛋白含量的作用［7］，进而激活了下游的Ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent protein kinase，CaMK)，而其中最为重要的一员CaMKⅡ，是一种重要的DC细胞成熟与功能的调节剂，研究人员［12-13］发现，CaMKⅡα能够促进TOLL样受体(Toll Like Receptor，TLR)激发的促炎细胞因子和IFN的表达，这一过程所表达的细胞因子包括 IL-12，IL-6，TNF-α 以及 IFN-β 等。除此之外，激活 CaMKⅡ使得 DC表达 MHC-Ⅱ［14］，并上调由DC诱导的T细胞的增殖，以及与免疫稳态和免疫调制有关的DC细胞的抗原提呈能力。CaMKⅡ通过影响转录、转录后以及翻译后这3个阶段的进行，实现对于MHC-Ⅱ的含量与定位到DC细胞膜的能力的调节。而这一机制与DC在炎症中的作用调节密切相关。

此外有文献报道［15］，CaMKⅣ可以作为 Toll样受体4(TLR4)的激动剂，激活的TLR4可以磷酸化cAMP效应因子结合蛋白(cAMP response element-binding protein，pCREB)，进而激活下游的Bcl－2基因，构成一个 CaMKⅣ-pCREB-Bcl-2的作用机制，而这一机制对于DC细胞的存活至关重要，消除TLR4受体的小鼠表现出DC数目的下降与存活时间的缩短。但该机制尚有许多细节未能阐述清楚。

1.4 蛋白激酶C与免疫细胞

MENK可以提高中性粒细胞内蛋白激酶C(PKC)的含量，使用PKC的抑制剂N-feruloylserotonin［16］，通过抑制 PKC，导致 MENK 对于中性粒细胞的调节作用被完全封闭。Hamdorf M［17］在造血干细胞的研究中发现，PKC对于骨髓造血干细胞的分化至关重要。在使用粒细胞集落刺激因子(MG-CSF)与白细胞介素-4(IL-4)诱导骨髓造血干细胞分化为DC的过程中，激活了大量的激酶，包括细胞外信号调节激酶(Extracellular-signalregulated kinase，ERK)、PKC 与两面神激酶(Janus Kinase，JAK);其中PKCδ被发现可以磷酸化在骨髓造血干细胞分化为DC过程中的关键转录因子PU.1，进一步研究表明PKCδ在骨髓造血干细胞分化为DC的过程扮演了重要角色。

PKC在DC中作用还表现在对于IL-12等重要细胞因子的影响之中［18］，进一步的研究还揭示了PKCδ(-/-)的老鼠体内DC细胞所产生的IL-12p40 与 IL-12p70 的量明显减少［19］。PKC-α 对于干扰素调节因子3(Interferon Regulatory Factor-3，IRF-3)依赖性的IL-12p35和IL-27p28，及其下游的Toll样受体-3(TLR-3)与Toll样受体-4(TLR-4)的基因表达均有控制作用，这一点已经在PKCα(-/-)的老鼠体内被证实［20］。

1.5 MENK作用后免疫细胞抗肿瘤活性的变化

MENK通过与阿片受体相结合，通过前述的3条途径，激活了大量免疫细胞的活性，而其中又以在免疫调节过程扮演关键角色的DC的变化最为重要。Liu J等［21］通过体内及试管内的实验发现MENK可以促进骨髓源性的DC的成熟。在使用MENK治疗之后，骨髓源性DC细胞表面的MHC-Ⅱ类分子和主要的免疫相关分子的表达都增加了。并通过RT-PCR验证了MENK可以增加骨髓源性DC细胞表面的δ和κ阿片受体的表达。同时，MENK可以促进骨髓源性DC细胞分泌高水平的促炎症细胞因子，如IL-12p70和肿瘤坏死因子(TNF-α)。此外，早期的研究也发现，经MENK作用后，小鼠脾来源的DC迅速分化成熟，其表面可高度表达 MHC-Ⅱ，CD86、CD80、CD40，同时高分泌 IL-12、IL-2 与 IL-4［22-24］。激活后的 DC 在肿瘤的免疫反应过程中的关键作用主要表现为:DC能募集和扩增T细胞的免疫特异性，进而通过FAS受体或释放细胞因子的方法，促进肿瘤细胞的凋亡或者坏死;同时DC细胞参与到了T细胞长期免疫状态的维持之中。

1.6 MENK的其他作用

MENK在体内还被称为阿片生长因子(opioid growth factor，OGF)，故而阿片受体又被称为阿片生长因子受体(opioid growth factor receptor，OGFr)，够成了一个OGF(MENK)-OGFr通路。在对自身免疫性疾病的研究中，人们发现 OGF(MENK)-OGFr通路在T细胞中表现为抑制细胞的增殖过程，而且这一抑制作用有明显的剂量依赖性［25］。但是在小鼠脾来源的DC使用常规的OGFr抑制剂纳曲酮(NTX)，使用针对OGF多肽的抗体，又或者使用小干扰 RNA(siRNA)干扰OGFr的合成(包括 μ、δ，κ 等三类受体)，并不能影响OGF对于T细胞增殖的抑制作用。而使用针对p16或p21基因的siRNA，却能够使得OGF无法起效［25］。故有学者认为OGF可能直接通过与p16、p21这一类周期素依赖性蛋白激酶抑制物(cyclin dependent kinase inhibitors，CDKI)相互作用，而在细胞分裂的G1期参与调节，最终抑制细胞增殖。但具体机制尚未明确。此外，在针对多发性硬化与脑脊髓炎的研究中［26］，OGF可以通过抑制细胞生长起到控制病情恶化的临床作用，这从一个侧面支持了OGF对于细胞增殖潜在的抑制作用。

2 MENK与肿瘤的关系

MENK可以激活免疫细胞(主要是树突状细胞)发挥抗肿瘤的作用，与此同时OGF-OGFr通路，也已被证明与多种肿瘤的发生密切相关，这为通过增强OGF-OGFr通路表达，而发挥抗肿瘤作用提供了新思路。不同于OGF与CDKI之间存在的，无法用阿片受体阻断剂阻止的抑制细胞增殖的未知机制。在肿瘤细胞中OGF-OGFr通路的抑制肿瘤细胞生长的作用，可以为阿片受体阻断剂所抑制。具体表现为，在胰腺癌细胞中［27］，OGFOGFr通路构成了调节肿瘤细胞生长的抑制机制，OGF作为唯一一种能够抑制癌症细胞生长的阿片肽类物质，通过使用其抑制剂纳曲酮可以抑制OGF的这一作用，从而证明OGF-OGFr通路抑制胰腺癌细胞生长的作用。在鳞状细胞癌［28］、宫颈癌［29］、肝母细胞癌［30］、肝细胞癌［31］、滤泡源性的甲状腺癌［32］等肿瘤中均发现了类似的作用。OGF-OGFr通路中的借助核转运蛋白实现对于DNA合成的抑制，DNA下降大约34% ～46%左右［32-33］，从而实现对于肿瘤生长的抑制作用，并抑制肿瘤血管的形成，使其失去营养供给。OGFOGFr通路作为一种抑制肿瘤细胞生长的非毒性且高效的治疗方案，其临床价值已被发现。

目前认为，上述的抗肿瘤作用与OGF-OGFr通路被激活之后细胞内DNA合成的减少有关，与CDKI等组成的调往通路的关系尚不明确［25，34］。此外咪喹莫特(imiquimod)可以通过激活OGFOGFr通路而发挥抑制肿瘤细胞生长的作用，但咪喹莫特本身并不是阿片受体的激动剂或抑制剂，也不会参与到诱导细胞凋亡的过程中［35］。

3 展望

通过探讨MENK激活免疫细胞(离不开DC关键性的免疫调节作用)发挥抗肿瘤作用的机制，为肿瘤的自身免疫疗法提供了有力的理论依据，并在一些与免疫系统相关的疾病的治疗中具有重要临床价值，如艾滋病［36］、多发性硬化症［26］和脑脊髓膜炎［26］。MENK作为一种内源性分泌物，在不具有细胞毒性的同时，表现出较强的抑制肿瘤生长的能力，且抗肿瘤谱极宽(凡表达OGFr的肿瘤细胞均有效)。近年美国食品及药品管理局已经批准了基于DC的抗肿瘤疫苗的研发。但是，探讨如何克服肿瘤微环境对于免疫细胞生长、分化的抑制作用［37］，探讨如何克服肿瘤细胞分泌的前列腺素 E［38］、血管内皮生长因子(VEGF)［39］对于DC抗肿瘤机制的抑制作用，探讨如何应对某些特殊情况下，由DC参与的肿瘤生长与免疫逃逸等一系列负面过程包括DC参与的某些延淋巴扩散的肿瘤的稳定［40］，以及DC通过稳定内皮细胞而与肿瘤细胞共同完成的肿瘤内皮屏障的形成等过程［41］)，诸多问题都是研究所遇到的瓶颈。综上所述，研究MENK的激活免疫细胞抗肿瘤的活性有着重大的科学与临床价值，但也存在诸多问题需要深入研究。

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