罗哌卡因对大鼠DRG神经元GABAA受体激活电流的影响*

杨 越，司军强，樊 超，马克涛，成洪聚，李 丽△

（1.新疆民族高发病教育部重点实验室，2.石河子大学医学院生理教研室，石河子832002；3.武汉大学基础医学院生理教研室，湖北武汉430071；4.石河子大学医学院第一附属医院麻醉科，新疆石河子832002）

罗哌卡因（ropivacaine）［1］是一种新型的、纯左旋体长效酰胺类的局部麻醉药和镇痛药，由于罗哌卡因对运动神经的鞘膜、神经膜和血脑屏障的穿透能力以及蓄积能力较小，而对C类神经纤维（无髓鞘，与痛觉传导有关）的阻滞速度快于其对Aδ类纤维（有髓鞘，与运动功能有关）的阻滞，故认为是罗哌卡因出现感觉与运动神经分离［2］阻滞的药理学基础，这对在临床上用于需要镇痛而无需运动阻滞是非常理想的选择。罗哌卡因现已广泛应用于临床麻醉和疼痛治疗［3］。关于罗哌卡因的作用机制，迄今为止已提出以下几个方面：作用于L型Ca2＋通道的二氢吡啶结合位点［4］；抑制开放性 K＋通道的关闭［5］；对钠离子通道的抑制作用［6］等。罗哌卡因药理作用的发挥亦可能是多种机制共同作用后的综合效应。γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA）是脊髓中主要的抑制性神经递质，参与了疼痛的调节。本研究即应用全细胞膜片钳技术在新鲜分离的大鼠背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）神经元上观察罗哌卡因对大鼠DRG神经元GABA激活电流是否存在影响，以探讨罗哌卡因产生镇痛作用可能存在的作用机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

罗哌卡因、胶原酶、胰蛋白酶、EGTA、GABA、HEPES均为Sigma公司产品，其余均为国产分析纯试剂

1.2 液体配制

玻璃微电极内液成分为（mmol／L）：CaCl21；MgCl22；KCl 140；HEPES 10；EGTA 11，电极电阻 3～10MΩ。灌流外液成分为（mmol／L）：NaCl150；CaCl22.5；MgCl21；KCl 5；HEPES 10；D-glucose 10。

1.3 实验动物

选用由新疆维吾尔自治区疾病控制中心动物饲养科提供的4～6周龄SD大鼠，体重150～250 g，雌雄不拘，动物质量符合一级标准。

1.4 DRG神经元急性分离

关于大鼠DRG神经元标本急性分离方法及全细胞膜片钳记录技术详见文献［7］。概述如下：取4～6周龄SD大鼠，击昏、断头后迅速取出胸腰段脊柱沿脊柱正中剖成两半，置pH值为 7.4，渗透压为340mosm／kg的预充氧 DMEM液（dubecco’smodified eagle’smedium）内。由剖开的椎管内侧取出DRG及其相连的前、后神经根和脊神经，置培养皿中，体视显微镜下以精细角膜剪及游丝镊，仔细剪除与DRG相连的神经及结缔组织被膜，剪碎清除干净的DRG，取胶原酶 1.5 mg／ml，胰蛋白酶 0.6 mg／ml至试管中，在37℃恒温箱内孵育12 min，间隔4 min吹打30下。孵育毕，加适量大豆胰蛋白酶抑制剂终止酶的消化作用。以1 000 r／min离心6 min，弃上清液，将沉淀物以灌流外液重悬，吹打分散后将DRG神经元移至35 mm培养皿内静置30 min待细胞贴壁后行膜片钳记录。

1.4 膜片钳记录

全细胞膜片钳记录所用仪器为美国Axon 700B放大器。当玻璃微电极（美国Sutter公司P-97拉制仪拉制，电极阻抗为3～12 MΩ）与细胞膜间形成高阻（1～8 GΩ）封接后进一步将膜吸破，给予电容和串联电阻补偿。置保持电压在-60 mV。膜电流经低通滤波（10 Hz，-3 dB）。药物以外液配制，pH值用NaOH调到 7.4，渗透压为 340 mosm／kg，排药管直径为0.5mm，管口与所记录细胞距离100μm，实验室温度在（20～28）℃范围之间进行。

1.5 统计学分析

应用 Clampfit 10.2（Axon，美国）和 SPSS17.0软件进行数据分析，实验结果以均数±标准差（±s）表示；给药前后差异采用随机化配对资料均数的t检验进行分析。

2 结果

所记录的DRG神经元呈圆形或椭圆形，部分细胞可连有卷曲的离断轴突残端，选取轮廓清晰，折光性好，直径在15～35μm之间的细胞。

2.1 罗哌卡因对DRG神经元膜电流的作用

灌流罗哌卡因（0.1～1 000μmol／L）可使大部分（65.7%，48／73）DRG神经元产生一幅值在 0～380 pA的具有浓度依赖性的内向电流。罗哌卡因介导反应的最低浓度为 0.1μmol／L，EC50为 23.46 μmolL，最大反应浓度为 1 000μmol／L（图 1）。

Fig.1 Concentration-dependent depolarization induced by ropivacaine on DRG neurons

2.2 GABA对DRG神经元膜电流的影响

实验共检测了98个DRG神经元，其中74.5%（73／98）对外加 GABA敏感，并能被 GABAA受体特异性拮抗剂荷包牡丹碱（100μmol／L）所阻断（图2），浓度为0.1～1 000μmol／L的外加 GABA可引起具有浓度依赖性和明显去敏感作用的内向电流。

2.3 罗哌卡因对GABA激活电流的增强作用

2.3.1 同一浓度罗哌卡因对不同浓度GABA激活膜电流的增强作用 预加罗哌卡因（10μmol／L）后GABA激活电流明显增强，这种增强作用可以被细胞外液洗脱（图 3A），预加罗哌卡因（10μmol／L）后GABA激活电流与外加GABA本身激活电流的量效曲线比较，曲线明显上移（P＜0.05）。其EC50分别为 11.78μmol／L和 15.24μmol／L（n＝18）两者之间无显著性差异（P＞0.05）（图3B）。灌流罗哌卡因后GABA激活电流的最大值较之对照增强约153%±4.13%（n＝3）。

Fig.2 Effectof bicuculline on the GABAA receptor

Fig.3 Enhancement effectof GABA-activated currents by ropivacaine

2.3.2 罗哌卡因预灌流不同时间对GABA激活电流增强作用的影响 实验中我们观察了罗哌卡因预灌流时间对其增强GABA激活电流作用的影响，分别选取 0（即不作预灌流）、10、20、30、40 s等多个时间点进行观察。发现罗哌卡因（10μmol／L）对GABA（100μmol／L）激活电流的增强作用随预灌流时间的延长而增加，分别增强了 17.1%±3.5%、31.1%±6.6%、46.9% ±15.2%、89.1% ±2%、73.2% ±19.3%（各时间点n＝3）。在大约30 s之后罗哌卡因对GABA电流的增强作用随预灌流时间延长而增强的幅度有所下降，故认为在预灌流罗哌卡因30秒时其增强作用最显著（n＝3），各时间点增强率比较，差异极显著（P＜0.01，图 4）。

2.3.3 不同浓度罗哌卡因对同一浓度GABA激活电话的增强作用 预灌流罗哌卡因（0.1～1 000 μmol／L）30 s后给予外加100μmol／LGABA能显著增强 GABA（100μmol／L）激活电流的幅值。

Fig.4 Relationship between the time of pre-perfusion ripivacaine and the enhancementof EGABA currents

Fig.5 Enhancement effect of giving 100μmol／L GABA by preperfusion with different concentrations of ropivacaine（0.1～1 000μmol／L）

3 讨论

本研究在大鼠DRG神经元上观察到罗哌卡因自身所引起的具有浓度依赖性的膜电流。其产生原因可能与罗哌卡因引起神经元膜上某种离子通道开放，造成阴离子外流或阳离子内流等有关。由于此种电流幅值比较小（＜380 pA），且不稳定，因而本文未就其具体机制作深入探讨。DRG神经元上GABA引起具有浓度依赖性和明显去敏感作用的内向电流，此电流可以被GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱所阻断［8］，不同浓度的罗哌卡因对IGABA均表现为明显的增强作用，表明罗哌卡因发挥其增强IGABA作用的作用位点可能在GABAA受体上。GABAA受体作为氯离子（Cl-）通道的门控受体，不仅有GABA结合位点还有变构剂结合位点，罗哌卡因使Cl-内流增加，提示罗哌卡因可能与GABA位点特异性结合直接或间接易化了GABA受体活性，或者参与了GABAA受体的变构从而增强了GABA作用于受体的效能。由图4可以看到，随着预灌流罗哌卡因的时程增长，其对GABA激活电流的增强作用也加大，但是灌流40 s甚至更长时间后罗哌卡因的这种增强作用有所减弱，其最大效应的发挥出现在灌流时间30 s时。如图5所示的，灌流罗哌卡因在高浓度（1 000μmol／L）时其增强GABA激活膜电流的作用强度出现下降，但仍表现为明显的增强作用，故认为其最大效应的发挥大概出现在100μmol／L浓度时。

GABA作为脊髓中重要的抑制性神经递质，其突触前抑制作用的发挥大部分是由GABAA受体介导的，杜冬萍［9］曾在急性新鲜分离的大鼠海马锥体神经元观察罗哌卡因对GABAA介导氯电流的影响，以探讨局麻药中枢毒性反应的可能机制，其观察到不同浓度的利多卡因、罗哌卡因、布比卡因对IGABA都有明显的抑制作用，由此认为这种抑制作用可能是局麻药中枢致惊厥的产生机制。而本文在大鼠DRG神经元上的实验结果证实，罗哌卡因对GABAA受体功能具有增强作用，GABA作为抑制性神经递质，其突触前抑制作用被增强，从而可使罗哌卡因表现出更明显的镇痛作用，由此可见罗哌卡因对初级传入突触前抑制存在作用，说明罗哌卡因产生镇痛作用可能是在外周神经元通过增强GABA受体作用而发挥的。

总之，罗哌卡因增强GABAA受体介导的突触前抑制作用可能是其产生镇痛作用的机制之一。其具体机理可能是：1.罗哌卡因通过结合GABA位点或者参与GABAA受体的变构增加Cl-通道开放频率和开放时间从而增加Cl-流量；2.直接激活 Cl-通道引起Cl-内流，从而增强GABAA受体介导的突触前抑制效应，使初级感觉信息（尤其是痛觉）传入神经末梢的动作电位减小，进而引起相关神经递质在神经末梢的释放减少，造成脊髓背角的痛敏神经元活动减少从而发挥镇痛作用。

【参考文献】

［1］ Udelsmann A，SilvaW A，deMoraes A C，etal.Hemodynamiec efffects0f ropivacaine and levobupivacaine intravenous injection in swines［J］.ActaCirBras，2009，24（4）：296-302.

［2］ Panousis P，Heller A R，Koch T，etal.Epidural ropivacaine concentrations for intraoperative analgesia duringmajor upper abdominal surgery：a prospective，randomized，dubbleblinded，placebo-controlled study［J］.AnethAnalg，2009，108（6）：1971-1976.

［3］ 于 卫，马薇涛.不同浓度罗哌卡因腰麻用于高龄患者髋部手术的临床观察［J］.实用医学杂志，2011，27（1）：101-103.

［4］ Liu BG，Zhuang X L，Li ST，etal.Effects of bupivacaine and ropivacaine on high-voltage-activated calcium currents of the dorsal horn neurons in newborn rats.［J］.Anesthesiol，2001，95（1）：139-143.

［5］ Akiyoshi Oda，Hidenori Ohashi，Seiichi Komori，etal.Characteristics of Ropivacaine Block of Na＋channels in rat dorsal root ganglion neurons［J］.AnesthAnalg，2000，91（5）：1213-1220.

［6］ Udelsmann A，SilvsW A，De Moraes A C，etal.Hemodynamic effects of ropivacaine and levobupivacaine intravenous injection in swines［J］.ActaCirBras，2009，24（4）：296-302.

［7］ Si JQ，Li ZW，Fan Y Z，etal.Modulatory effect of substance Pon GABA and GABA-activated currents from ratdorsal root ganglion［J］.Actapharmacolsin，2004，25（5）：623-629.

［8］ 朱 贺.神经病理性痛大鼠DRG神经元GABAA受体激活电流的变化［D］.石河子大学，2010.

［9］ 杜冬萍，局麻药影响海马神经元GABA＜，A＞-CL＜’-＞电流和K＜’＋＞电流的实验研究［D］.复旦大学，2001.