土埋15年尸骨DNA检验1例

杨耕野，李呈核，韩海军

（1.南通市公安局刑警支队，江苏南通 226007；2.南通市公安局交巡警支队，江苏南通 226007）

土埋15年尸骨DNA检验1例

杨耕野1，李呈核2，韩海军1

（1.南通市公安局刑警支队，江苏南通 226007；2.南通市公安局交巡警支队，江苏南通 226007）

法医遗传学；DNA；骨骼；牙

1 案例

1.1 简要案情

1997年12月，田某将其养女杀死后逃窜。2012年9月，经调查怀疑田某在案发后第3天被烧死在一河堤上，尸体已被当地警方掩埋于地下，挖出尸体后，提取其部分四肢骨和牙齿以及田某妻子、女儿血样送检，以确定尸源。

1.2 检验过程

取该尸体股骨1根、左下颌第三磨牙和左下颌第二磨牙，清洗检材后备检。

股骨DNA的提取：用刀片切取股骨骨骺端骨松质约0.4g，切碎后置于2mL离心管，加入1mL 0.5mol/L EDTA脱钙液（pH=8.0），置于恒温振荡器56℃脱钙24h，期间更换4次EDTA脱钙液。用TES缓冲液代替EDTA脱钙液洗涤沉淀物1次，加入TES缓冲液500 μL、10%SLS裂解液100 μL、10 mg/mL PK裂解液50μL、1mol/L DTT液50μL，振荡混匀后置于恒温振荡器56℃中保存2h，按文献[1]所述方法提取DNA。

牙齿DNA的提取：将两颗牙齿分别敲碎后置于两支2mL离心管并做好标记，每管加入TES缓冲液500 μL、10%SLS裂解液100 μL、10 mg/mL PK裂解液50μL、1mol/L DTT液50μL，振荡混匀后置于恒温振荡器56℃中保存2h，转移至99℃保温10min。将上述消化液转移至另一2mL离心管内，用1.2mL吸附液分3次洗涤消化过的牙齿碎块，并将洗涤后的液体全部转移至离心管中，以离心半径5cm，12000r/min，离心2 min，上清液分别转移至新的2 mL离心管中。按文献[1]所述方法提取DNA，模板用15 μL TE液溶解。

对照血样DNA（田某妻子、女儿血样）的提取按文献[2]所述方法进行。

将股骨、牙齿及对照血样的DNA分别采用Identifiler Plus试剂盒进行扩增，采用10μL体系，扩增产物经3500XL遗传分析仪进行检测，GeneMapper IDX软件进行基因分型。

分型结果见图1～3，该尸体的股骨和牙齿均与对照血样不符合亲缘关系。左下颌第三磨牙扩增产物的15个基因座均获得了质量较好的STR分型结果，而左下颌第二磨牙在D7S820、D18S51等大片段基因座上出现了非特异性扩增和漏扩的情况，图谱质量较差。

图1 股骨骨骺端骨松质STR分型图谱

图2 左下颌第三磨牙STR分型图谱

图3 左下颌第二磨牙STR分型图谱

2 讨论

骨骼和牙齿是法医DNA检验中较为常见的生物检材。骨组织内的细胞由于被钙化的细胞外基质所保护，可以得到长久的保存，这是陈旧尸骨DNA检验的基础，但这种保护也给骨细胞的裂解带来很大困难，EDTA脱钙是目前比较常用的方法[1]，脱钙的时间一般要大于24h。牙齿由牙釉质、牙本质、牙骨质3种钙化的硬组织和牙髓软组织组成，硬组织的结构与骨密质相似，裂解其内的细胞也需要脱钙，而牙髓组织含有丰富的血管和神经，位于牙腔内，由3种坚硬的钙化组织保护着[3]，牙根尖处仅有的开口又往往受到上下颌骨的保护，对外界环境因素也有很强的抵抗力，所以提取牙髓组织的DNA时，只需要充分暴露牙腔，即可直接对牙髓内的细胞进行裂解。本案例中，对牙齿的处理采用了粉碎牙齿、暴露牙腔后通过蛋白酶直接消化牙髓的方法，所以在时间上就比骨组织的检验周期大大缩短，在牙髓保存完好的情况下检验效果也比较好。

此外，牙齿的选取也会直接影响检验的效果。第三磨牙又称智齿，萌出时间最晚，通常在青春期才萌出，此时颌骨发育已近成熟，若颌骨没有给智齿的发育留出足够的空间，会影响其正常萌出[4]。分析本案例，左下颌第三磨牙就属于阻生牙，其牙冠的咬合面无法与上颌牙齿磨合，反致牙冠各面均保持得非常完好，其内部的牙髓也就得到了较好的保存，而第二磨牙为龋齿，牙冠有破坏的痕迹，可能导致牙腔暴露，不利于牙髓的保护。所以在检案中可选择第三磨牙或牙冠无破坏的磨牙，以得到更为完整的STR分型结果。

[1]贾东涛，韩海军，张玉红，等.陈旧骨骼DNA提取方法的应用研究[J].中国法医学杂志，2007，22（4）：260-261.

[2]王林生，苏勇，顾林岗.硅珠法提取PCR模板DNA[J].中国法医学杂志，2000，15（1）：36-37.

[3]毛祖彝.口腔科学[M].第3版.北京：人民卫生出版社，1991：3.

[4]柏树令，应大君.系统解剖学[M].第6版.北京：人民卫生出版社，2004：121.

DF795.2

B

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.04.028

1004-5619（2013）04-0319-02

2013-03-14）

（本文编辑：李成涛）

杨耕野（1986—），男，黑龙江哈尔滨人，主要从事法医物证鉴定工作；E-mail：yanggengye@yahoo.com.cn