藏獒16个STR基因座的遗传多态性

熊新，张晓峰，穆立伟，王梦蕾，杨金龙，张博，莽九旺，邓亚军

（1.北京华大方瑞司法物证鉴定中心，北京 101318；2.中国畜牧业协会犬业分会，北京 100028）

·技术与应用·

藏獒16个STR基因座的遗传多态性

熊新1，张晓峰2，穆立伟1，王梦蕾1，杨金龙1，张博1，莽九旺1，邓亚军1

（1.北京华大方瑞司法物证鉴定中心，北京 101318；2.中国畜牧业协会犬业分会，北京 100028）

目的 通过对449头藏獒的16个STR基因座遗传多态性进行研究，建立藏獒的基因多态性数据库。方法选用犬荧光标记16个STR复合扩增试剂盒进行PCR扩增，对扩增产物进行检测及统计学分析。结果449头藏獒的16个STR基因座累积个体识别率为0.999 999 999 999 999，累积非父排除率为0.999997795，除FH2010（等位基因数10）、PEZ21（等位基因数12）、PEZ05（等位基因数13）外，其余STR基因座的等位基因数均在15个以上；16个STR基因座的杂合度均＞0.5，多态信息含量均＞0.7。结论16个犬STR基因座在藏獒中具有较高的个体识别能力，可用于藏獒的个体识别和亲权鉴定。通过本研究获得的各种数据，可用于建立藏獒的DNA多态性数据库。

法医遗传学；多态现象，遗传；短串联重复序列；藏獒

随着DNA分析技术的发展，法医个体识别和亲权鉴定的应用从人不断扩展到动物，尤其是哺乳动物领域。而养殖、繁育、买卖藏獒已经是近年来人们关注的重点，因此而产生的产业链每年交易额高达十亿元，一头品相俱佳的藏獒，成交额可高达千万元。但是在藏獒的繁育和交易过程中，人们迫切希望能够通过DNA检测，对交易的藏獒进行身份认定或亲权鉴定，以确定藏獒的父方、母方是否品种纯正，这也是国际犬业协会推荐的标准。

国内已有一些利用STR基因座对犬进行遗传学的研究，王海生等[1]对湖北地区德国牧羊犬10个微卫星DNA基因座遗传多态性进行了研究，徐波等[2]对纯种犬在15个STR基因座上的遗传多态性及亲权鉴定方面进行了研究。本研究选择了由16个犬类STR基因座组成的荧光复合扩增系统，并检测449头藏獒STR基因座的遗传多态性，以期为藏獒的个体识别和亲权鉴定提供方法，为亲缘鉴定和同一认定提供数据，顺利建立藏獒的DNA数据库。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本

449份取自2011年沈阳藏獒新秀赛A级纯种健康藏獒口腔拭子样本。

1.1.2 主要仪器与试剂

9700型PCR扩增仪，3130XL遗传分析仪均购自美国AB公司。InteliGene Search Dog STR荧光检测试剂盒购自北京玉衡普泰科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取方法

采用Chelex-100法[3]对藏獒个体口腔拭子样本进行DNA提取。

1.2.2 PCR复合扩增

选用InteliGene Search Dog STR荧光检测试剂盒（PEZ01、PEZ06、PEZ08、PEZ16、PEZ03、PEZ11、FH2010、PEZ12、PEZ05、PEZ20、PEZ17、FH2079、PEZ21、FH2054、PEZ15、PEZ13）。扩增采用10 μL体系，内含：4 μL反应混合液，2 μL Dog STR引物混合液，1 μL热启动Taq酶，1 ng模板DNA，去离子水补至10μL。在9700型PCR扩增仪上进行扩增。热循环参数为：94℃11min；94℃45s，55℃60s，72℃60s，31个循环；60℃60min。4℃保存备用。

1.2.3 扩增产物的分离和检测

扩增产物以离心半径5cm，3000r/min，离心3min，取1μL产物与0.5μL Marker-500内标和9μL去离子甲酰胺混合，95℃变性3min后冰浴，3130XL遗传分析仪电泳检测。采用GeneMapper ID v3.2软件进行数据分析。

1.2.4 数据统计及分析

根据各基因座等位基因数目、杂合子数目计算16个STR基因座的各基因型频率、等位基因频率、匹配概率（Pm）、杂合度（H）、个体识别率（DP）以及各基因座累积个体识别率（CDP）、多态信息含量（PIC）、累积非父排除率（CPE）和非父排除率（PE）等群体遗传学参数，并对频率分布进行Hardy-Weinberg平衡的验证。

2 结果

对449头纯种藏獒的16个STR基因座进行扩增和检测，均得到较好的分型结果。经Hardy-Weinberg平衡检验，P＞0.05。各基因座的等位基因及其频率分布见表1。根据基因型检测结果，计算得到各基因座的群体遗传学参数见表2。结果表明，该16个STR基因座均具有较高的遗传多态性，平均H为0.775，平均PIC为0.841，CDP达到0.999 999 999 999 999，CPE达到0.999997795。

表1 藏獒16个STR基因座等位基因频率分布（n=449）

续表1

表2 藏獒16个STR基因座群体遗传学参数

3 讨论

等位基因数目反映了某个基因座在进化过程中所积累的遗传变异，等位基因数量越多说明在进化史上这个基因座突变越活跃，导致物种在自然选择中发展的取向越多，对生活环境适应的潜能越大。同时遗传学参数中的H和PIC在评价物种多样性上有很重要的意义。H是用来定量评估一个遗传标记的多态性程度的，也就是群体中杂合子的频率。PIC是评价基因座多态性的一个量化概念，是指在某一家系中可以利用基因座多态性作为遗传标记进行基因连锁分析的概率。与H一样，标记基因座的等位基因数越多，各等位片段频率越均匀，PIC越大[4-5]。当PIC＞0.5时，该基因座为高度多态基因座；当0.25＜PIC＜0.5时，为中度多态基因座；当PIC＜0.25时，该基因座为低度多态基因座[6]。

本研究选择的16个STR基因座的PIC值均在0.7以上，H也在0.5以上，均属于高度多态性的基因座。所有基因座均有10个以上等位基因，其中PEZ13这个基因座的等位基因数目高达50个。FH2010的等位基因数最少为10个，在这16个犬STR基因座中，等位基因数目大于15个的有13个，表明这16个STR基因座具有高度的遗传多态性。通过数据比对，本实验中各基因座的PIC值和DP值（除PEZ16外）均高于王海生等[1，7]报道的数据。

本实验共检测了449头藏獒的样本，这些藏獒的源头基本都来自青海玉树地区，来源基本稳定，到内地经过繁殖、交配和交易，存在参赛藏獒中有可能来自同一父系或同一母系的情况。本实验得到的数据经比对发现：（1）8对样本的分型完全一致，核对信息发现，这8对藏獒的名字、毛色和性别等信息完全一致，但编号不同，可能为同一只藏獒重复编号所致；（2）另1对样本的分型一致，核对信息后发现其毛色和性别也一致，但名字不同且分别属于不同犬主，分析认为可能存在同卵双生关系；（3）另10对样本具有明确的亲子关系。由于这类具有明确亲缘关系的藏獒样本的存在，在进行Hardy-Weinberg平衡验证时出现了部分基因座不符合的现象。

本研究使用的试剂盒为国内公司研制的含有16个STR基因座的荧光标记试剂盒，其CPE和CDP均远远大于目前美国AB公司同类商品化试剂盒的能力，可有效应用于犬的个体识别和亲权鉴定。而且藏獒类亲缘鉴定、同一认定等所需的基因频率等数据，均为纯种藏獒专用数据。本研究中群体样本较大，通过实验获得的各种数据包括基因频率等，都可协助用于进行纯种藏獒数据库的建立。但不同犬种、不同品系之间是否存在差别，需要增加品系和样本进行验证。

[1]王海生，王祥，张文平，等.湖北地区德国牧羊犬10个微卫星DNA基因座遗传多态性研究[J].刑事技术，2003，（2）：12-14.

[2]徐波，熊勇华，涂祖新，等.纯种犬在15个STR基因座上的遗传多态性[J].生物技术，2006，16（2）：28-31.

[3]吴微微，郑秀芬.一种改良Chelex方法提取血痕DNA[J].刑事技术，1999，（1）：20-21.

[4]郑秀芬.法医DNA分析[M].北京：中国人民公安大学出版社，2002：384-385.

[5]侯一平.法医物证学[M].第3版.北京：人民卫生出版社，2009：21-22.

[6]Ladon D，Schelling C，Dolf G，et al.The highly polymorphic canine microsatellite ZuBeCa6 is localized on canine chromosome 5q12-q13[J].Anim Genet，1998，29（6）：466-467.

[7]金鑫，凃政，姜成涛，等.藏獒犬11个STR基因座遗传多态性[J].中国法医学杂志，2009，24（1）：39-42.

Genetic Polymorphisms of 16 STR Loci in Tibetan Mastiff

XIONG Xin1,ZHANG Xiao-feng2,MU Li-wei1,WANG Meng-lei1,YANG Jin-long1,ZHANG Bo1,MANG Jiu-wang1,DENG Ya-jun1
（1.Center of Forensic Science,Beijing Genomics Institute,Beijing 101318,China;2.China Animal Agriculture Association National Kennel Club,Beijing 100028,China）

ObjectiveTo explore the genetic polymorphisms of 16 STR loci from 449 Tibetan Mastiffs in order to set up gene polymorphism database of Tibetan Mastiff.MethodsThe PCR amplification was performed using the 16 STR loci fluorescent multiple amplification kit for dog.The amplified products were detected and statistically analyzed.ResultsIn the 16 STR loci from 449 Tibetan Mastiffs,CDP was 0.999999999999999 and CEP was 0.999997795.Except FH2010（10 alleles）,PEZ21（12 alleles）, and PEZ05（13 alleles）,the other STR loci had more than 15 alleles.In the 16 STR loci,H was>0.5 and PIC was>0.7.ConclusionThe 16 STR loci have high polymorphism to be suitable for individual identification and paternity testing of Tibetan Mastiff.The data obtained through this study can be used to establish DNA polymorphism database of Tibetan Mastiff.

forensic genetics;polymorphism,genetic;short random repeats;Tibetan Mastiff

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.04.012

1004-5619（2013）04-0282-04

2012-08-09）

（本文编辑：李成涛）

熊新（1982—），男，北京人，主要从事法医DNA检验工作；E-mail：13810088725@139.com

邓亚军，女，副主任法医师，主要从事法医DNA检验工作；E-mail：dengyj@genomics.org.cn