骨保护素对骨-腱愈合促进作用的研究

安 明，刘 金，冯晶晶，孟 婧

（1.保定市第一中心医院 骨科，河北保定 071000；2.河北大学附属医院 妇科，河北保定 071000）

交叉韧带是保持膝关节稳定的最重要的结构，一旦损伤难以自愈，常常需要手术重建交叉韧带，但由于骨-腱的愈合远比骨-骨的愈合要慢，主要原因是骨-腱愈合不良，所以如何促进骨-腱愈合是目前临床研究的热点。本文将骨保护素（osteoprotegerin，OPG）加入前交叉韧带重建动物模型中，观察不同时期骨-腱的愈合情况，旨在为临床提供促进骨-腱愈合新的治疗方法。

1 材料和方法

1.1 一般资料

选取24只成年新西兰白兔，购于河北大学动物实验中心，雌雄不限。OPG购于上海希美生物科技有限公司。

1.2 模型制作及分组

将24只新西兰白兔编号，随机分为2组，每组12只。A组于骨腱结合面间注入骨保护素，B组为空白对照组。

1.3 标本处理及检测方法

模型的制备：实验兔采用质量浓度为0.6%戊巴比妥钠2ml/kg体重静脉全麻。在实验兔后腿做一长约3cm的膝正中切口，充分暴露前交叉韧带并完全切除。在胫骨和股骨上各打一条直径2.0mm的骨隧道。然后分离股骨内侧肌群找到半腱肌并于肌腱与肌腹交界处切断，修整半腱肌肌腱并将其自内侧副韧带的浅层穿经胫骨及股骨隧道，于屈膝位拉紧，最终缝合于外侧副韧带上。对侧关节做相同处理。A组膝关节股骨及胫骨骨隧道内分别注入浓度为50ng/ml骨保护素0.15ml，B组膝关节内不注入任何物质。冲洗关节腔及手术切口，逐层缝合，敷料包扎。术后允许兔在笼中活动。

1.4 观察指标

1.4.1 一般情况

观察术后动物饮食、关节活动及伤口愈合情况。

1.4.2 组织学观察

分别于术后3周，6周和12周末每组各处死2只实验动物，并于膝关节上3cm截断股骨，膝关节下3cm截断胫骨后取得完整膝关节标本，标本经体积浓度为10%甲醛水溶液固定72h后，脱钙72h（体积浓度45%的盐酸45ml，体积浓度55%甲酸55ml加蒸馏水450ml构成脱钙液），常规冲水、脱水、浸渍、包埋、切片，HE染色。光镜下观察，主要观察骨-腱愈合情况。

1.4.3 生物力学检测

分别于术后3周、6周和12周末每组各处死2只实验动物，并于膝关节上4cm截断股骨，膝关节下4cm截断胫骨后取得完整膝关节标本，离断膝关节标本上除前交叉韧带外的所有组织联结，离断后将胫骨及股骨端分别固定于力学试验仪牵拉台两端，以5.0mm/s的拉力进行牵拉试验至肌腱从骨隧道中脱出，并记录肌腱从骨隧道中脱出时的加载负荷。

1.5 统计学方法

统计学分析应用SPSS16.0统计软件包。计量资料组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 组织形态学变化

术后3周（图1、2，封底）：A组的骨隧道与肌腱结合面间可见软骨细胞并逐渐钙化成骨，原有骨小梁周围有大量成骨细胞增生。B组显示移植腱周围仅有大量细胞外胶原纤维生成，呈不规则结构，偶尔可见胶原纤维与骨隧道的连接。术后6周标本（图3、4，封底）：A组的结合面间有部分新骨生成，组织中含有部分成骨细胞和软骨细胞。B组的骨隧道与肌腱结合面可见新骨生成，组织中含有较多成骨细胞，移植腱与新生骨部分形成纤维软骨连接。术后12周标本（图5、6，封底）：A组的骨隧道与肌腱结合面间几乎全部有新骨生成，骨-腱间呈连续性纤维软骨连接，形成类似正常的韧带止点结构。B组的骨隧道与肌腱结合面间仅见少量新骨的生成，骨-腱结合面间可见部分肌腱与周围骨组织呈纤维软骨连接。

表1 3周、6周及12周时2组的生物力学试验结果（x¯±s，N）

2.2 生物力学试验结果

表1示第3周时，2组的力学结果分别为15.03±1.57N、13.99±1.40N，差异无统计学意义（P＞0.05）。第6周时，2组的力学结果分别为23.92±1.24N、16.42±1.53N，差异有统计学意义（P＜0.01）。第12周时，2组的生物力学结果存在统计学差异（P＜0.01）。

3 讨论

骨保护素（OPG）主要作用是影响骨代谢，可抑制破骨细胞的发生，并促进破骨细胞的凋亡，所以又被称为破骨细胞抑制因子[1，2]。OPG在骨代谢过程中具有极其重要的生物学功能[3]，阐明它在骨代谢过程中的作用和功能，有望为骨质疏松、韧带重建等多方面的治疗提供新的思路。

OPG在人体内的平均浓度为0.5～5.0μg/l[4，5]，本实验参照人体内的浓度范围，观察不同时期OPG对骨腱愈合的作用。通过本研究发现，3周时前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）全部断裂时拉伸力量在2组无显著性差异（P＞0.05），免疫组化图片上显示二组骨隧道与肌腱结合面间有少量纤维组织增生，形成薄层纤维组织，试验组有少量成骨细胞。也就是说早期OPG未与隧道壁形成稳定的连接。6周时ACL全部断裂时拉伸力量在A组与B组有显著性差异（P＜0.05），表明试验组骨-腱愈合更牢固。在6周以后免疫组化图片上显示：A组和B组韧带止点周围结缔组织和骨增生明显，并在韧带与骨之间出现类似末端结构样连接，骨隧道与肌腱结合面有大量新骨生成，组织中含有大量成骨细胞，移植腱与新生骨紧密结合形成纤维软骨连接。从而认为OPG可通过诱导新骨生成、促进纤维结缔组织的生成来促进韧带与骨之间的早期牢固愈合[6]。12周时，A组、B组均形成连续性纤维软骨连接，形成类似正常的韧带止点结构。ACL全部断裂时拉伸力量在A组与B组有显著性差异（P＜0.05），这一结果提示：OPG成骨作用最为明显[7]。

OPG作为重要的骨代谢相关因子日益得到广泛的应用，在今后的实验中，我们将在不同时间段或加入不同浓度的OPG，为其早日在临床应用提供理论依据。

[1]田虹，樊瑜波.OPG、RANK、RANKL的结构、作用机制和在骨疾病中的作用[J].现代生物医学进展，2010，20：67-68.

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[3]Belibasakis GN，Bostanci N.The RANKL-OPG system in clinical periodontology[J].J Clin Periodontol，2011，24：10.

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[5]Sandberg WJ，Yndestand A.Enhanced T-cell expression of r-ANKL ligand in acute coronarsyndrome：possible role in plaque destabilization [J].Arterioscler Thromb Vase BioI，2006，26：857-863.

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[7] Abdallah BM，Stilgren LS，Nissen N，et al.Increased RANKL/OPG mRNA ratio in iliac bone biopsies from women with hip fratures[J].Calcif Tissue Int，2005，76（2）：90-97.