兔出血症不同佐剂灭活疫苗的制备及免疫效果比较

叶青华

（成都农业科技职业学院，四川 成都 611130）

1 材料与方法

1.1 试验用兔 成都农业科技职业学院实训场饲养的未经兔出血症疫苗免疫的商品兔，体重2～2.5kg。

1.2 种毒 RHDV地方毒株。采取兔出血症病死兔的肝、脾组织，去除周围的筋膜，在灭菌生理盐水中清洗数次，加适量PBS液，于组织匀浆机中完全捣碎，然后按1∶5比例加入灭菌PBS液，经37℃～-80℃反复冻融3次。1500r/min离心10min，取上清液，再加入1000IU/mL的青、链霉素，37℃感作2h。将上述处理好的病料，感染未经免疫的敏感兔，使其发病。取发病兔的肝组织加灭菌PBS液捣碎，1500r/min离心10min，取上清液，HA滴度在1∶1280以上即可备用。

1.3 佐剂 蜂胶，氢氧化铝胶。

1.4 兔出血症不同佐剂灭活苗的制备

1.4.1 兔出血症组织灭活苗的制备 无菌采取人工感染发病后的兔肝、脾，按1∶10比例加入灭菌PBS液捣碎，1500r/min离心10min，在上清液中加入0.4%的甲醛，放在37℃摇床中灭活48h。

1.4.2 兔出血症蜂胶佐剂灭活苗的制备 取市场上购置的优质蜂胶捣成细末，按1∶4的比例加入95%的食用酒精，置23℃水浴24 h，其间不断摇匀，取出冷至室温，3 800 r/min离心30 min，取上清液即为蜂胶乙醇浸液。将1.4.1制备的兔出血症组织灭活苗与蜂胶乙醇浸液按1∶3比例混合，匀浆，4℃下作用24 h即成蜂胶佐剂疫苗。

1.4.3 兔出血症铝胶佐剂灭活苗的制备 用去离子水将三氯化铝配成8%的溶液，加温至56～60℃；再用去离子水将氢氧化钠配成4%的溶液，缓慢加入三氯化铝溶液中，调节pH至5.6～6.0，再加温10min，分装瓶中，121℃高压蒸汽灭菌30min，即成铝胶佐剂。将1.4.1制备的兔出血症组织灭活苗与铝胶佐剂按1∶1比例混匀，即成铝胶佐剂灭活苗。

1.4.4 疫苗检验 按常规方法检查其物理性状，并进行菌检及安全性检验。

1.5 免疫接种 选取未经兔出血症疫苗免疫的试验兔16只，随机分成4组，每组4只，隔离饲养。1～3组分别于颈部皮下注射兔出血症组织灭活苗、蜂胶佐剂苗、铝胶佐剂苗1mL，第4组于颈部皮下注射灭菌生理盐水1mL。接种后7、14、45、85、145d进行耳静脉采血，用微量法作血凝抑制试验检测抗体效价。

1.6 攻毒保护试验 攻毒病料制备：将兔出血症病料加入少量PBS液在组织捣碎机中充分磨碎，然后制成1∶5悬液，经37℃～-80℃反复冻融3次。1500r/min离心10 min，取上清液,内加1 000 IU/mL的青、链霉素，37℃感作2h即成。

试验兔全部攻毒。分别在疫苗接种后7、15、50、90、150d进行攻毒试验，每只肌注病料液1mL。

2 结果

2.1 抗体检测 4组试验兔全部进行抗体检测，其结果见表1。

2.2 攻毒保护试验 非免疫对照组试验兔48h内全部死亡，剖检均呈现出典型的兔出血症症状。免疫组攻毒结果详见表2。

表1 免疫兔血清抗体检测结果

表2 攻毒保护试验结果

3 小结与讨论

3.1 3种疫苗均于免疫后7d产生抗体，此时，蜂胶佐剂苗的抗体滴度最高，铝胶佐剂苗的抗体滴度最低。14d后，佐剂苗的抗体滴度均高于组织灭活苗的抗体滴度，其中以蜂胶佐剂苗的抗体滴度最高。45d后抗体滴度均有所下降，但以蜂胶佐剂苗的抗体滴度下降最慢。据报道，蜂胶佐剂苗在免疫30d后抗体滴度高达211，几乎是组织灭活苗抗体滴度的2倍，且还有上升趋势。表明蜂胶佐剂灭活苗的抗体滴度高于其他2种疫苗，这与蜂胶既能促进机体对抗原产生特异性免疫反应，又能启动机体非特异性免疫反应有关。由此可见，蜂胶佐剂灭活苗吸收快，产生效价高而持久，是值得推广的新型疫苗。组织灭活苗中的抗原成分在短时间内即能被组织大量吸收，产生较高水平的抗体。铝胶佐剂灭活苗由于抗原成分释放缓慢，产生高水平抗体所需的时间较长。

3.2 从攻毒保护试验来看，3种疫苗均能有效抵抗兔出血症强毒的攻击。免疫后7d，铝胶佐剂灭活苗的抗体滴度最低，为26.5，但攻毒后试验兔均能成活，而非免疫对照组全部死亡，说明26.5抗体滴度已能有效抵抗兔出血症强毒的攻击。免疫后150d攻毒，免疫组试验兔虽有不同程度的死亡，但以组织灭活苗组的死亡率最高，达75%，蜂胶佐剂灭活苗组死亡率最低，达25%。表明组织灭活苗的免疫期较佐剂疫苗短，而蜂胶佐剂灭活苗的免疫期较长。据报道，兔出血症灭活苗的免疫期为4～6个月，合理攻毒试验应在免疫后10d内或4个月后，这样才能更好地看出不同佐剂疫苗在保护率方面的差异。

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