HLA-DRB1基因多态性与糖尿病并发肺结核易感性的研究①

王育华，王玉浔，安雅臣，纪春梅，刘国荣，赵晓晶，高素玲，张江，王艳，冯福民

HLA-DRB1基因多态性与糖尿病并发肺结核易感性的研究①

王育华1，王玉浔2，安雅臣2，纪春梅3，刘国荣2，赵晓晶2，高素玲2，张江2，王艳2，冯福民2

目的探讨HLA-DRB1基因多态性与我国北方汉族糖尿病并发肺结核易感性的关系。方法采用1∶1配对的病例对照研究设计，以我国北方汉族124例糖尿病并发肺结核患者为研究对象，以与病例同民族、同性别、年龄相差不超过3岁，相同居住地(城市或农村)，且经统一结核菌素试验(PPD)确认为有结核分支杆菌感染的2型糖尿病患者为对照组；采用聚合酶链反应-特异性序列引物(PCR-SSP)的方法检测HLA-DRB1基因DR15、DR16、DR1、DR11位点多态性，对与肺结核相关的危险因素进行问卷调查，应用SPSS软件进行单因素和多因素条件Logistic回归分析。结果在病例组中，携带DR15基因突变型患肺结核的风险增高(OR＝2.461,95%CI:1.363～4.444,P=0.002)；DR15位点突变与DR16位点突变同时存在时风险更大(OR=4.904,95%CI:1.554～15.476)。对17个环境危险因素进行单因素分析，在多因素分析中调整卡痕、体质量指数、家族史3个因素后，DR15突变基因型仍与糖尿病并发肺结核显著相关(OR=2.996,95%CI:1.51～5.945)。结论HLA-DR15基因突变型可能为2型糖尿病并发肺结核的易感基因型。

结核；肺；糖尿病；HLA基因；基因多态性；病例对照研究

1 对象与方法

1.1 对象

1.1.1 病例组 2010年3月～2012年6月在唐山市结核病医院连续确诊的2型糖尿病并发初治继发型肺结核患者，糖尿病和肺结核的诊断明确，糖尿病病程在1年以上，且确诊时间早于肺结核1年以上，并排除肺炎、肺癌、尘肺、长期使用肾上腺皮质激素及其他免疫抑制剂、HIV感染等免疫功能低下可能影响易感性的患者。

1.1.2 对照组 对照组来自河北联合大学附属医院同期住院的2型糖尿病患者，且要求与病例同民族、同性别、年龄相差不超过3岁，相同居住地(城市或农村)，且经统一结核菌素试验(PPD)确认为有结核分支杆菌感染的2型糖尿病患者(有卡痕者PPD硬结反应平均直径≥10 mm[4-5]，无卡痕、无卡介苗接种史者PPD硬结反应平均直径5～10 mm)，且排除：①与研究对象有血缘关系；②现在或既往有结核病史。本研究采用1∶1匹配的方法，严格按照对照组纳入排除标准选择2型糖尿病患者为对照组，且保证与每例病例匹配的对照至少有2例，在其中随机选取1例与病例结为对子。另外咳嗽2周以上或经胸部X线检查有可疑肺结核病变者也予以排除。

1.2 方法

1.2.1 问卷调查 设计统一的专用调查表，经过预调查及反复修订后正式应用。采用面对面问卷调查形式，由经过统一培训的调查人员逐一询问调查表内容并认真填写，内容包括研究对象出生年月、职业、文化程度、民族、婚姻状况、呼吸系统疾病史及其他重大疾病史、烟酒嗜好、卫生习惯、饮食生活习惯、家庭经济状况、住房状况、家族患结核病情况、结核病接触史、卡介苗接种史及其他系统疾病史和服药史。

1.2.2 PPD试验筛选 所有入选人员均采用孟都氏(Mantous)法[4]行PPD实验检查。

1.2.3 基因组DNA的获取 每个研究对象晨起空腹抽取静脉血5 ml，2%EDTA 0.5 ml抗凝，冰盒保存。采用低渗溶血法分离白细胞，常规酚/氯仿抽提法提取基因组DNA。

1.2.4 聚合酶链反应(PCR)扩增目的DNA片段 引物设计参照参考文献[5]，反复核实碱基序列，委托大连宝生物公司合成引物，同时合成NRAMP1-Exon8作为阳性内参照物，如表1。PCR扩增体系：25 μl体系，其中1U Taq DNA聚合酶，2.5 μl 10×PCR Buffer，5.0 μl dNTPs，上下游引物各1.0 μl，DNA模板1.0 μl，灭菌双蒸水14.5 μl。循环体系：94℃预变性60 s，94℃变性60 s，60℃复性30 s，72℃延伸30 s，5个循环；94℃变性15 s，60℃复性25 s，72℃延伸20 s，终末延伸72℃300 s，28个循环。以DR15位点为例，扩增产物于1.5%的琼脂糖凝胶电泳，以DL-2000为标准分子量，样品在紫外灯下观察(234 bp为内参)。

1.3 统计学分析

采用EXCEL 2003建立数据库，SPSS 12.0进行统计分析，显著性水平α=0.05。采用条件Logistic回归模型进行单因素分析和多因素逐步回归分析。计算各因素的比值比(OR)及其95%可信区间(CI)，来估计相对危险度(RR)。显著性检验采用最大似然比检验方法。

2 结果

2.1 一般情况

在连续收治的124例汉族成人糖尿病并发肺结核住院患者中，男性83例(66.9%)，女性41例(33.1%)，两者比例约为2∶1；来源于农村的患者75例(60.5%)，来源于城市的患者49例(39.5%)，两者比例约为3∶2。男性患者平均年龄(47.0±15.8)岁，女性平均年龄(37.4±14.7)岁。按照对照组配对条件最后随机抽出124例糖尿病患者作为对照组，其中男性平均年龄(44.9±15.2)岁，女性(42.3±12.1)岁，经配对t检验(t＝0.843和1.671，P＞0.05)与病例组年龄无显著性差异。

2.2 有关因素的条件Logistic回归分析

研究因素的赋值方式见表1。

2.2.1 单因素分析 经单因素条件Logistic回归分析发现，与糖尿病并发肺结核发病有联系的因素有：体质量指数(BMI)、卡介苗接种史、卡痕、结核病接触史和结核病家族史。BMI≤20、无卡介苗接种史、无卡痕、接触史、结核病家族史等因素会增加肺结核发病的危险性；而BMI高则能减少肺结核发病的危险性。DR15基因型肺结核发病的风险亦增高，故DR15基因突变型可能是糖尿病并发肺结核发病易感基因型。见表2。

2.2.2 多因素分析 为排除各研究因素之间的相互干扰作用，控制混杂因素的影响，我们将单因素分析中有显著意义的变量作为协变量，同时分别引入研究对象的基因型，以糖尿病患者肺结核是否发病为因变量，进行多因素条件Logistic回归分析，结果显示调整卡痕、家族史、BMI后，DR15突变基因型仍与肺结核发病显著相关(OR=2.996,95%CI:1.51～5.945)。见表3。

2.2.3 基因位点联合作用分析 为分析各基因位点多态性之间的联合作用，对各基因型多态性位点进行叉生分析。结果发现，在DR15位点突变的情况下，如果存在DR16位点突变，则肺结核发病风险更大。见表4。

表1 Logistic回归模型中各因素的赋值方式

表2 单因素条件Logistic回归分析

表3 肺结核病发病影响因素的多因素条件Logistic回归分析

表4 HLA-DRB1基因多态位点在两组中的联合分析

3 讨论

当前普遍认为，糖尿病患者体内胰岛素分泌不足，导致糖、蛋白质、脂肪代谢紊乱，造成营养不良，有利于结核杆菌的入侵和发展；同时因为糖尿病患者血内糖量增多，脂肪代谢异常，甘油产物蓄积，代谢性酸性环境均有助于结核杆菌的生长生殖[6]，致使并发结核病的机率增加。糖尿病由于糖代谢紊乱，导致糖原异生作用加强，蛋白分解加速以致抗体补体和免疫球蛋白生成减少，致使机体抗体水平减低和免疫力下降，降低机体防御功能。另外，糖尿病患者维生素A缺乏，使呼吸道黏膜上皮对外界感染抵抗力下降，易被结核杆菌感染。

大量遗传学证据表明，肺结核的发生是环境因素与机体遗传因素共同作用的复杂结果。现代结核病的研究和进展已经证明，个体对结核病易感性的差异部分是由宿主基因决定的。肺结核与细胞免疫密切相关。现代免疫学证实，T细胞受体-抗原肽-主要组织相容性复合体构成的三分子复合体是特异性细胞免疫应答的分子基础。因此，HLA与肺结核的相关性研究成为目前结核病研究领域的一个热点。

目前对于HLA基因与肺结核相关联的确切发生机理尚不完全清楚，普遍认为入侵的结核菌在巨噬细胞内得以繁殖生长，其抗原经由溶菌酶的处理或因巨噬细胞死亡而释出，通过HLA-Ⅱ类分子进行抗原呈递给辅助性T淋巴细胞(CD4+)表面特殊的淋巴细胞受体，使之致敏，并繁殖形成单克隆细胞系。当再次受抗原攻击时，淋巴细胞便产生多种淋巴因子，包括巨噬细胞和淋巴细胞趋化因子(CF)、巨噬细胞激活因子特别是干扰素-γ(INF-γ)、白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α和-β(TNF-α和TNF-β)，以及移动抑制因子(MIF)、有丝分裂因子(MF)、淋巴细胞转移因子(LTF)等，从而导致单核细胞趋化、留驻局部、激活、分裂繁殖以及未致敏直接转化为致敏淋巴细胞。同时研究还发现在CD4+细胞介导抗结核免疫反应过程中，抑制性T淋巴细胞(CD8+)也参与作用。这种作用通过HLA-Ⅰ类分子递呈。它溶解已吞噬结核菌和受抗原作用的巨噬细胞，使结核菌释放和扩散；它亦使宿主细胞溶解，造成组织破坏。另一方面，藏匿在宿主某些细胞中不能被杀灭的结核菌借助CD8+细胞对靶细胞的溶解作用而释放，进而为邻近部位具有高度杀菌活力的巨噬细胞吞噬和消灭[7-8]。

本研究显示：①HLA-DR15基因突变型可能是肺结核发病易感基因型；②DR15位点突变如果与DR16位点突变同时存在时，两基因联合作用可能具有协同作用，能显著增加结核病的易感性；③卡痕、BMI、结核病家族史可能是肺结核发病的危险因素。这与朱红[3]等研究的结果不同，这可能与研究目标人群及对照组的选择有关。

随着人类基因组计划的完成和后基因组时代的到来，越来越多的结核易感基因，如VDR(vitamin D receptor)基因、MBL(mannose binding lectin)基因和HLA (human leukocyte antigen)基因等被发现，而基因组流行病学研究的开展将使这些易感基因在不同人群中的分布、它们对疾病发生所起的作用及基因与基因间和基因与环境间的交互作用被逐步阐明。这有助于肺结核高危人群的预测，为优选干预措施(医学干预、行为干预或环境干预)提供科学依据。

[1]宣丽萍.老年Ⅰ型糖尿病80例病例分析[J].中华现代内科学杂志,2007,4(8):744.

[2]中华医学会.临床诊疗指南(结核病分册)[M].北京:人民卫生出版社,2005:122.

[3]朱红,王建华.2型糖尿病并发肺结核病的危险因素探讨[J].中华流行病学杂志,2006,27(1):58-59.

[4]宋文虎.结素试验，卡介苗接种的理论与实际[M].北京:中国防痨协会,1998:16.

[5]Rajalingam R,Mehra NK,Jain RC,et al.Polymerase chain reaction-based sequence-specific oligonucleotide hybridization analysis of HLA class II antigens in pulmonary tuberculosis: relevance to chemotherapy and disease severity[J].Infect Dis, 1996,173:669-676.

[6]王光亮,吴沛霞,雷涛.肺结核合并糖尿病82例临床分析[J].临床肺科杂志,2007,12(7):683.

[7]Resende Co T,Hirsch CS,Toossi Z,et al.Intestinal helminth co-infection has a negative impact on both anti-mycobacterium tuberculosis immunity and clinical response to tuberculosis therapy[J].Clin Exp Immunol,2007,147:45-52.

[8]El-Masry S,Lotfy M,Nasif WA,et al.Elevated serum level of inter-leukin(IL)-18,interferon(IFN)-gamma and 9 soluble Fas in patients with pulmonary complications in tuberculosis[J]. Acta Micro-biol Immunol Hung,2007,54:65-77.

Relationship between HLA-DRB1 Gene Polymorphisms and Susceptibility of Pulmonary Tuberculosis in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus:124 Case-control Study

WANG Yu-hua,WANG Yu-xun,AN Ya-chen,et al.Department of Neurology,Affiliated Hospital,Hebei United University,Tangshan 063000,Hebei,China

ObjectiveTo investigate the association between the HLA-DRB1 gene polymorphisms and susceptibility of pulmonary tuberculosis(TB)in patients with type 2 diabetes mellitus in North China.MethodsA 1∶1 matched case-control study was adopted.Polymerase chain reaction-sequence-specific primers techniques(PCR-SSP)and restriction fragment length polymorphism(RFLP)was used to type polymorphisms(DR15,DR16,DR1,DR11).Information on environmental-related risk factors and pathological changes of tuberculosis was collected using a pre-tested standard questionnaire.Variance analysis,Chi-square,univariate and multivariate conditional Logistic analysis were conducted with SPSS 12.0 for Window.ResultsA sample of 124 pairs of cases and controls was studied.Univariate analysis demonstrated that DR15 mutant increased the risk of susceptibility of pulmonary tuberculosis(OR＝2.461,95%CI:1.363～4.444,P=0.002), and it would further increased if DR16 mutant occurred together(OR=4.904,95%CI:1.554～15.476).In multivariate analysis,DR15 mutant also associated with susceptibility of pulmonary tuberculosis(OR=2.996,95%CI:1.51～5.945).ConclusionPolymorphism of DR15 genotype might be a susceptible genotype of TB patients with type 2 diabetes mellitus in North China.

tuberculosis;pulmonary;diabetes;HLAgene;polymorphism;case-control study

R587.1

A

1006-9771(2013)06-0561-04

河北联合大学博硕科研基金(No.BS05010)。术，从遗传学角度探讨HLA基因多态性与我国北方汉族成年糖尿病患者并发肺结核的关系，为我国结核病防治提供新的思路。

2013-01-04

2013-03-20)

1.唐山市结核病医院，河北唐山市063000；2.河北联合大学，河北唐山市063000；3.唐山市协和医院，河北唐山市063000。作者简介：王育华(1970-)，女，汉族，河北乐亭县人，副主任医师，主要研究方向：结核病内科学。通讯作者：安雅臣。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.06.017

[本文著录格式]王育华，王玉浔，安雅臣，等.HLA-DRB1基因多态性与糖尿病并发肺结核易感性的研究[J].中国康复理论与实践,2013,19(6):561-564.

糖尿病是由不同原因引起的人体内胰岛素绝对不足或相对不足，以致糖、脂肪和蛋白质代谢发生障碍，而引起以高血糖为共同特征的临床综合征。中国糖尿病患者总数超过欧洲和美国糖尿病患者的总和，到目前为止估计有3000万，居世界第二位[1]。由于糖尿病患病率增加、结核发病“回潮”(发达国家)和控制不良(发展中国家)，糖尿病并发结核病人数也逐年增多，糖尿病患者中肺结核的发生率是正常人的4～8倍[2]。而糖尿病又是肺结核重要的相关性疾病，糖尿病患者是结核病的易感者，而结核病又是诱发、加重糖尿病发生酮症酸中毒等急性并发症的重要常见的原因之一[3]。因此，两病的并发一直是临床医师所关注的重要课题。本研究采用1∶1配对病例对照研究设计，利用聚合酶链反应-特异性引物序列(PCR-SSP)技