预防性应用槲皮素对吸入性损伤大鼠肺治疗效果的影响

刘娅平，张建明，刘 群，冯世海，赵永健，施 耘，肖长栓

（1.天津医科大学研究生院，天津300070；2.天津市第四医院烧伤科，天津300222）

吸入性损伤是一种多数发生在封闭火场、病情发展迅猛的烧伤危重症，患者的死亡率极高。虽然有研究证明某些炎症介质参与了吸入性损伤及其全身继发性损害，但尚无控制这些炎症因子的临床治疗方法。使用有效药物及其给药时间可能对患者病情发展有较强的干预作用。有研究表明，槲皮素具有清除氧自由基的作用，在慢性阻塞性肺疾病大鼠模型中，槲皮素通过抑制活性氧和活性氮起到抗氧化应激的作用[1]。对吸入性肺损伤的作用尚不清楚。本实验通过槲皮素对大鼠烟雾吸入性损伤模型的预防性治疗作用，研究其对自由基及炎症介质的影响及对肺水清除的作用，探讨其对烟雾吸入性肺损伤的预防和治疗作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 槲皮素（Sigma公司），IL-6ELISA试剂盒、TNF-αELISA试剂盒（美国R&D公司），大鼠SOD试剂盒、MDA试剂盒、iNOS试剂盒（南京建成公司），光学显微镜（OLYMPUS），ELX800UV酶标检测仪（BIO-TEK），微量加样器（eooendorf），Centrifuge5702离心机（EPPENDORF公司），LEICA石蜡切片机。

1.2 动物分组及处理 雄性SD大鼠40只，体质量（200±20）g（天津春乐实验动物提供）。采用随机数字表法随机分为4组：正常对照组（A组）、致伤空白组（B组）、槲皮素治疗组（C组）、槲皮素预防组（D组），每组10只。D组在致伤前10min腹腔注射槲皮素（200mg/kg）。除A组外，其余各组参照相关文献[2]制作大鼠烟雾吸入性损伤模型。C组在致伤后3h腹腔注射槲皮素（200mg/kg），B组于致伤后3h腹腔注射等量的生理盐水，A组无处理。上述过程中无大鼠死亡等意外情况发生。

1.3 标本采集 各组于伤后72h取腹主动脉血5mL，以3000r/min离心15min后，留上清液，于-20℃冰箱冻存待测TNF-α，IL-6。将大鼠处死，取其左肺迅速冻存于-70℃冰箱中待测MDA、SOD、iNOS。以4%甲醛灌洗肺动脉，以右肺用丝线扎紧肺门，置于4%甲醛中固定，留待做病理切片检查。取少量右肺组织做肺组织干湿比。

1.4 指标检测 （1）按照试剂盒说明书以双抗体夹心ELISA法测血清IL-6（pg/mL）、TNF-α（ng/L）含量。（2）用滤纸将肺组织表面吸净，制成匀浆，采用考马斯亮蓝蛋白测定法测匀浆液中蛋白浓度。参照试剂盒说明书，分别测定SOD（U/mg）、MDA（nmol/ mg）、iNOS（U/mg）活力。（3）将留待病理以4%甲醛固定好的右肺组织脱水、石蜡包埋、切片，在苏木精-伊红（HE）染色后行光镜观察。（4）取少量右肺组织称重后置于80℃恒温烤箱中48h，取出称干重，肺含水量=（肺湿重-肺干重）/肺干重。

2 结果

2.1 肺病理切片检查 光学显微镜下，A组肺泡腔结构清晰，肺泡间隔均匀，肺泡壁均匀光滑（图1）。B组组织表现为肺泡不同程度扩张或萎陷，大小形态明显异常，肺泡结构模糊不清，肺泡间隔不均匀，肺间质和肺泡壁内可见中性粒细胞浸润（图2）。C组组织水肿较B组明显减轻，部分肺泡大小形态可见异常，毛细血管扩张，管周仍有少量红、白细胞浸润，肺间质及肺泡腔内炎症细胞渗出轻于B组（图3）。D组损伤程度又小于C组（图4）。

2.2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平的比较 见表1。与A组比较，B、C、D组IL-6及TNF-α水平明显升高（P<0.01）。与B组比较，C、D组TNF-α水平及IL-6水平显著降低（P<0.01）。与C组比较，D组TNF-α水平及IL-6水平显著降低（P<0.01）。

表1 各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较（±s）Tab 1 Comparison of TNF-α,IL-6in the serum of the rats in each group（±s）

表1 各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较（±s）Tab 1 Comparison of TNF-α,IL-6in the serum of the rats in each group（±s）

与A组相比#P<0.01，▲P<0.01，△P<0.01；与B组相比#P<0.01，▲P<0.01；与C组相比#P<0.01

组别A组B组C组D组n 10101010TNF-α/(pg/mL）106.12±3.07245.92±2.51△209.61±5.85▲158.23±4.43# IL-6/(pg/mL) 140.21±26.15210.04±2.02△182.59±4.08▲150.89±2.89#

2.3 各组大鼠肺组织MDA、SOD、iNOS水平的比较 见表2。与A组比较，B、C、D组MDA及iNOS水平显著升高（P<0.01），SOD水平显著降低（P< 0.01）。与B组比较，C、D组MDA、iNOS含量显著降低（P<0.01），SOD水平显著升高（P<0.01）。与C组比较，D组MDA、iNOS含量显著降低（P<0.01），SOD水平显著升高（P<0.01）。

表2 各组大鼠肺组织MDA、iNOS、SOD水平比较（±s）Tab 2 Comparison of SOD,iNOS，MDA in the lung tissue of rats in each group（±s）

表2 各组大鼠肺组织MDA、iNOS、SOD水平比较（±s）Tab 2 Comparison of SOD,iNOS，MDA in the lung tissue of rats in each group（±s）

与A组相比#P<0.01，▲P<0.01，△P<0.01；与B组相比▲P<0.01，#P<0.01；与C组相比#P<0.01

组别A组B组C组D组n 10101010MDA/(nmol/mg) 2.39±0.154.06±0.35△3.65±0.46▲2.97±0.56# iNOS/（U/mg) 0.77±0.412.01±0.26△1.74±0.31▲1.25±0.32# SOD/（U/mg) 361.32±2.0852.03±0.64△254.35±1.15▲312.67±0.98#

2.4 各组大鼠肺组织含水量的比较 见表3。与A组比较，B、C、D组肺含水量均升高（P<0.01）。与B组比较，C、D组肺含水量均降低（P<0.01）。与C组比较，D组肺含水量降低（P<0.05）。

表3 各组大鼠肺组织含水量的比较（±s）Tab 3 Comparison of the water content of the lung tissue of rats in each group（±s）

表3 各组大鼠肺组织含水量的比较（±s）Tab 3 Comparison of the water content of the lung tissue of rats in each group（±s）

与A组相比#P<0.01，▲P<0.01，△P<0.01；与B组相比，▲P<0.01，#P<0.01；与C组相比#P<0.01

组别A组B组C组D组n 10101010肺组织含水量/（g/g) 3.34±0.657.76±0.35△6.45±0.76▲5.57±0.86#

3 讨论

研究表明，自由基产生和释放的增加导致的应激反应在肺损伤的发病机制中十分重要[3]，当机体清除氧自由基的能力下降时，肺组织产生的氧自由基最易损伤肺脏的组织细胞从而造成肺损伤。槲皮素的化学名称为（3,3,4,5,7-）五羟基黄酮，具有酚羟基，属于黄酮类化合物中的黄酮醇亚类，黄酮类化合物的酚羟基H就是与自由基反应的最大可能活性部位，通过与自由基发生抽氢反应消除自由基起到抗氧化作用。槲皮素可凭借其含有的酚羟基基团发挥清除自由基和抗过氧化的作用。槲皮素具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集和清除自由基等多种生物学活性[4]，吸入性损伤也具有上述病变中存在的过氧化等问题，因此笔者推断槲皮素可能对吸入性肺损伤具有良好的预防和治疗效果。

本实验病理切片显示致伤组大鼠肺泡不同程度扩张或萎陷，肺泡毛细血管扩张充血，肺泡间隔不均匀，证明烟雾吸入性损伤模型制作成功，效果稳定可靠。

肺泡毛细血管内皮细胞和中性粒细胞等炎症细胞在烟雾吸入性损伤的致伤过程中可释放TNF-α、IL-6等各种细胞因子，并有花生四烯酸、蛋白酶等代谢产物产生，形成肺水肿及管型，使肺血管氧含量降低[5]。IL-6和TNF-α是引起肺损伤的重要促炎症介质，通过生成细胞因子和炎症趋化因子激活炎症级联反应，增加内皮黏附因子的表达，促进中性粒细胞对血管内皮细胞的黏附[6]。在本实验中检测血清IL-6及TNF-α含量，间接反映肺组织炎性损伤的程度。在实验中，按照相关文献报道[7]，对C组采用槲皮素200mg/kg腹腔注射作为实验剂量，并观察其肺治疗效果。实验结果表明，B、C、D组血清TNF-α及IL-6水平较A组显著升高，而C组较B组TNF-α及IL-6水平降低，D组较C组水平更低。实验结果提示了槲皮素能有效缓解吸入性损伤造成的肺损伤，且预防性用药效果更好。

本实验病理切片结果显示，致伤后肺泡结构模糊，炎症细胞浸润，C组肺泡结构较B组清晰，肺毛细血管管周及肺泡腔内炎症细胞浸润减少，且预防性给药病理变化减轻。有研究表明，肺干湿比的变化可反映肺损伤程度的变化[8]。本实验结果显示C组较B组肺干湿比降低，D组又较C组低。所有这些结果进一步证明槲皮素可减轻吸入性损伤引起的肺损伤，且预防效果显著。烟雾吸入性损伤后，机体产生大量的氧自由基，使内皮细胞受损，造成MDA含量增加，SOD的含量剧烈下降。SOD是生理状态下体内的一种特异性酶，其活性的高低反映了机体氧自由基的清除能力[9]。因MDA也称脂质过氧化物酶，所以通过检测MDA活性来间接反映组织细胞脂质过氧化的严重程度[10]。肺组织中iNOS的过度表达会导致NO的过度生成，而过量的NO可刺激巨噬细胞释放大量的炎症介质，加重肺组织损伤。通过检测iNOS活性反映肺损伤的程度[11]。研究表明，槲皮素具有清除氧自由基和抗过氧化的作用。在本实验中，C组较B组MDA、iNOS水平降低，SOD水平增高，且D组上述变化更明显。提示槲皮素可通过清除自由基和抗过氧化减轻吸入性损伤造成的肺损伤，预防性用药效果更好。

综上，槲皮素可通过清除氧自由基和抗过氧化而对吸入性肺损伤起到一定的预防治疗作用，且预防用药效果更好，但是可否用于临床治疗及在具体治疗中用药剂量、浓度，给药方式等还须进一步研究探讨。

（本文图1～4见封三）

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