Twist1与Bcl-2协同促进肝癌细胞EMT 过程中的miRNA 表达谱变化

崔中水，孙保存，赵 楠，赵秀兰，董学易，古 强

（1.天津医科大学病理学教研室，天津300070；2.天津医科大学附属肿瘤医院病理科，天津300060）

自1999年Maniotis等[1]发现血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）这一新的肿瘤血供模式以来，国内外众多学者致力于其具体发生机制的研究，上皮间充质转变（epithelial-mesenchymal transition，EMT）即是其中一种[2-4]。经典的EMT调控蛋白Snail和Slug是通过结合E-cadherin转录的E-box抑制其表达，但近年研究发现Twist1还可以通过其他未知途径广泛地抑制上皮样表型并上调间充质表型，而且Bcl-2可以与Twist1协同作用，辅助Twist1入核，从而诱导EMT的发生，促进VM的形成[5-6]。miRNAs（microRNAs）是一类单链非编码内源性小分子RNA，其转录独立于其他基因，并不翻译成蛋白质，而是在体内代谢过程中起调控作用。近年来国内外均有报道miRNA在肿瘤中异常表达，这些异常表达的miRNA可以通过激活原癌基因的表达和抑癌基因的突变缺失，从而引起肿瘤的发生发展[7]。因此，我们推测Bcl-2与Twist1协同作用激活多个下游靶基因mRNA的转录活性是否可能是通过miRNAs表达变化来实现的？本实验通过分析对比Twist1、Bcl-2分别单独过表达和共过表达时的miRNA谱，旨在找出与Twist1和Bcl-2协同作用相关的miRNAs。

1 材料与方法

1.1 细胞系和培养条件 肝细胞肝癌细胞系HepG2，购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，美国）。

全部细胞按常规培养模式进行:培养基为Dulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM）添加10%胎牛血清（FBS），均购自Invitrogen公司（美国）。培养条件为37℃，5%CO2：恒湿环境（Binder培养箱，德国）。按不同要求，细胞传代扩增至60%～80%接触汇合后收获细胞。

1.2 表达质粒构建 Twist1基因CDS全长通过全基因合成（华大公司，深圳）获得，亚克隆入pcDNA3后测序，与Genebank序列比对确定正确开放阅读框用于后续实验；表达上调质粒pcDNA3-Bcl2通过cDNA文库亚克隆获得，经过测序验证。

1.3 质粒提取和细胞转染 以DH5α超级感受态细菌扩增穿梭质粒，常规转化大肠杆菌，氨苄青霉素抗性筛选单克隆，质粒大提，以TritonXll4抽提法去除内毒素。

细胞转染采用新型转染试剂：聚乙酞亚胺（percutanoous ethanol injection，pEI，polyseienee公司，Cat#23966）。细胞培养至70%～80%接触汇合，转染前一天更换为无血清培养液同步化细胞，转染当日首先更换无血清、无抗生素新鲜培养液，以1∶4比例混匀质粒和转染试剂，加入培养基，次日更换为条件培养液。24～48h后进行转染效果评价或其他实验。转染效率和蛋白分析效果如高于50%可直接用于后续实验。

1.4 miRNA芯片分析 采用空质粒、稳转Twistl、稳转 Bcl-2和稳转 Twist1/Bcl-2分别获得的HepG2-对照、HepG2-Twist1、HepG2-Bcl-2、HepG2-Twist1/Bcl-24组细胞作为样品，利用miRNA芯片技术方法检测不同处理对miRNA表达谱的影响。实验由北京博奥公司完成。

1.5 统计学分析 全部数据输入SPSS 13.5进行统计学分析，分别采用完全随机设计t检验（Student’s t test）和多组比较单因素方差分析（ANOVA），以P<0.01作为检验水准。

2 结果

2.1 共过表达Twist1/Bcl-2组与对照组比较miRNA表达谱 HepG2-Twist1/Bcl-2组比HepG2-对照组有11个miRNA表达高，有37个表达低（P< 0.01）（图1）。其中有2个miRNA表达高10倍以上（表1），有1个表达低10倍以上（表2）。

表1 HepG2-Twist1/Bcl-2组比HepG2-对照组表达高10倍以上的miRNATab 1 The miRNAs that expressed more than 10times higher in the HepG2-Twist1/Bcl-2group than in the HepG2control group

表2 HepG2-Twist1/Bcl-2组比HepG2-对照组表达低10倍以上的miRNATab 2 The miRNAs that expressed more than 10times lower in the HepG2-Twist1/Bcl-2groupthanintheHepG2controlgroup

2.2 共过表达Twist1/Bcl-2组与过表达Twist1组比较miRNA表达谱 HepG2-Twist1/Bcl-2组比HepG2-Twist1组有13个miRNA表达高，42个表达低（P<0.01）（图2）。其中有6个miRNA表达高10倍以上（表3），1个表达低10倍以上（P<0.01）（表4）。

表3 HepG2-Twistl/Bcl-2组比HepG2-Twistl组表达高10倍以上的miRNATab 3 The miRNAs that expressed more than 10times higher in the HepG2-Twist1/Bcl-2group than in the HepG2-Twist1group

表4 HepG2-Twist1/Bcl-2组比HepG2-Twist1组表达低10倍以上的miRNATab 4 The miRNAs that expressed more than 10times lower in the HepG2-Twist1/Bcl-2groupthanintheHepG2-Twist1group

2.3 共过表达Twist1/Bcl-2组与过表达Bcl-2组比较miRNA表达谱 HepG2-Twist1/Bcl-2组比HepG2-Bcl-2组有17个miRNA表达高，24个表达低（P<0.01）（图3）。其中有2个miRNA表达高10倍以上（表5），2个表达低10倍以上（表6）。

表5 HepG2-Twist1/Bcl-2组比HepG2-Bcl-2组表达高10倍以上的miRNATab 5 The miRNAs that expressed more than 10times higher in the HepG2-Twist1/Bcl-2group than in the HepG2-Bcl-2group

表6 HepG2-Twist1/Bcl-2组比HepG2-Bcl-2组表达低10倍以上的miRNATab 6 The miRNAs that expressed more than 10times lower in the HepG2-Twist1/Bcl-2group than in the HepG2-Bcl-2group

3 讨论

miRNAs是由染色体DNA编码，并在进化上高度保守，在细菌、病毒、真菌、植物和动物中都广泛表达。其功能机制是在细胞核首先由RNA聚合酶Ⅱ转录成初始转录子（pri-miRNA），pri-miRNA经蛋白复合体处理后形成miRNA前体（pre-miRNA，约70nt），pre-miRNA在胞质被Dicer（核酸内切酶RNaseⅢ）剪切成双链miRNA，双链中的一条与含Argonautes的RNA沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）形成RISC-miRNA复合物后与靶基因mRNA的3′UTR（3′非翻译区）完全或不完全的碱基互补结合，以实现其负性调节靶mRNA的功能，进而调节基因的表达。越来越多的研究发现，miRNA具有调节胚胎发育、细胞增殖、分化、凋亡等生物学功能[4]。miRNA与恶性肿瘤的发生、发展、预后有着密切的关联。各种研究相继报道了miRNA差异表达与恶性转化标志（异常细胞生长、细胞死亡、分化、凋亡、侵袭和转移）之间的分子功能联系[4]。

本研究即是针对EMT相关蛋白Twist1与抗凋亡蛋白Bcl-2共表达时出现的miRNA表达谱变化来初步分析Twist1和Bcl-2相互作用引发广泛生物学效应是否与某些miRNA相关。miRNA芯片结果表明：共过表达Twist1/Bcl-2可引起miRNA表达谱发生较明显变化，且其发生变化的miRNA数量和范围都不同于Twist1、Bcl-2单独任何一者过表达时的表达变化情况。

本实验组前期研究已经验证了质粒的转染效果是高效率的，而且表明Twist1能调控EMT表征蛋白E-cadherin表达下调、VE-cadherin表达上调进而促进EMT、VM，且共过表达Twist1/Bcl-2能使Twist1这一功能更强；通过比较4组细胞的功能发现共过表达Twist1/Bcl-2组的细胞增殖、迁移、侵袭和体内成瘤及在3D培养条件下形成管道等能力都比其他组明显要强[3]。本文利用miRNA芯片技术分析了空白对照、单独过表达Twist1、单独过表达Bcl-2和共过表达Twist1/Bcl-24组细胞的miRNA表达谱，初步发现同时过表达Bcl-2和Twist1可使miRNA表达谱发生明显变化，并且与单独过表达Twist1或Bcl-2时发生的变化都不同，这表明Twist1和Bcl-2相互作用使更广泛的miRNAs发生了变化或使变化更明显，从而使得细胞功能产生非常广泛的影响，甚至完全颠覆细胞表型。

本实验结果显示HepG2-Twist1/Bcl-2组与其他组相比差异倍数在10倍以上的miRNA有9个：hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-155、hsa-miR-1914、hsa-miR-424、hsa-miR-1246、hsa-miR-146a、hsamiR-200b、hsa-miR-4286、hsa-miR-193a-3p。在关于这9个miRNA在肿瘤生物学功能方面的研究中，miR-146b-5p通过靶向基质金属蛋白酶MMP16抑制神经胰腺癌细胞的迁移和侵袭[8]；miR-155经常在一些癌症中过表达，下调肿瘤抑制蛋白p53的表达，该蛋白与细胞凋亡相关[9]；hsamiR-1914尚未有研究发表；miR-424在肿瘤局部缺氧组织的血管重构及血管生成中发挥重要的促进作用[10]；has-miR-1246是细胞周期、凋亡和衰老相关基因p53家族的一个靶基因，并可通过抑制DYRK1A的表达激活NFAT，而NFAT的激活与肿瘤发生密切相关[11]；在前列腺癌的研究中发现，hsamiR-146a在去势抵抗性前列腺癌中成低表达，并且过表达hsa-miR-146a可抑制体外肿瘤细胞生长、克隆形成和迁移以及体内成瘤性和血管形成等功能，其机制研究表明hsa-miR-146a可靶向抑制EGFR的表达，并可抑制MMP2的表达[12]；miR-200家族（miR-200a,miR-200b,miR-200c,miR-141, and miR-429）是一类与EMT高度相关的miRNAs，而miR-200b被认为是肿瘤侵袭、转移和化学敏感性等的关键调控子[13]；hsa-miR-4286在皮肤黑色素瘤中表达比良性黑色素痣明显上调，但其发挥的具体作用目前尚未有发表[14]；hsa-miR-193a-3p在乳腺癌中作为肿瘤抑制因子通过与miR-124和miR-147共同靶向作用于EGFR进而抑制肿瘤细胞的细胞周期进程[15]。

在HepG2-Twist1/Bcl-2组发生变化的miRNA涉及异常细胞生长、细胞死亡、分化、凋亡、侵袭、转移及血管生成等多种功能，因此我们推测Twist1和Bcl-2协同作用使上述9个关键的miRNA发生明显的表达变化，导致miRNA对多个下游靶基因转录活性的调控作用发生改变，这些靶基因与细胞的信号转导、增殖、血管生成、细胞骨架形成等多方面有关，结果不仅增强了肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭等恶性功能，而且诱导了EMT的发生及VM形成，最终促进肿瘤恶性及进展。但这些在HepG2-Twist1/Bcl-2组发生变化的miRNA在肿瘤发生发展过程中具体发挥什么功能，哪些是与Twist1和Bcl-2的相互作用直接相关的miRNA以及调控VM和EMT的机制还有待进一步研究。

综上所述，本研究利用miRNA芯片技术发现共过表达Twist1/Bcl-2的HepG2肝癌细胞中miRNA发生明显的差异表达，结合功能变化结果说明众多miRNA发生表达变化可起到共同调控下游多个靶基因活性的作用，这一发现为进一步研究Twist1和Bcl-2相互作用引发肿瘤广泛生物学效应的具体机制提供了有用的数据库，而筛选出Twist1和Bcl-2可直接调控的miRNA并进行验证以及对这些miRNA进行功能学的研究则是作者下一步即将开展的工作。

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