大麻茎腐病菌的分离及其对土壤环境影响的研究

郑 楠，宋宪友，张利国，房郁妍，殷 博

（1.黑龙江省农业科学院经济作物研究所，黑龙江哈尔滨150086；2.黑龙江省微生物研究所，黑龙江哈尔滨150086）

大麻是一种生命力很强的一年生高大草本作物，具有耐寒、抗旱等多种优点。大麻植株自身可抵御各种病虫害，不需施加肥料、杀虫剂，且能够有效地改良土壤的盐碱化。大麻与大豆、玉米等粮食作物轮作，既可以保持土壤的肥力，也可以修复长期施肥造成的土壤污染。同时，大麻纤维长而坚韧，耐腐蚀性强，用大麻纤维织成的布料具有透气性好、吸水性强、耐磨、抗菌除臭等多种优点[1，2]，在改良土壤的同时也能带来极大的经济收入。大麻茎部病害的发生会导致韧皮纤维肿大、腐烂，严重影响大麻纤维的品质和产量，病害高发时，给农民的收入带来极大的损失。因此，对大麻茎部病害的发生、防治需要引起足够的重视。本研究从发病的大麻茎秆中分离病原菌，对病原菌的形态、生长条件进行测定，并对大麻对土壤pH值的影响进行初步的探索，以期为今后大麻对土壤环境影响的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜的大麻病变组织。

1.2 试验方法

1.2.1 病菌的分离及纯化

采集新鲜的大麻病变茎秆，反复冲洗。对病变组织进行表面消毒，分别用75%的酒精和无菌水浸泡3min，重复3次。将经过表面消毒的组织置于已配好的PDA培养基平板中，培养3～7 d。在长出的菌落中挑取单菌落进行纯化[3]。

1.2.2 病菌形态观察

刮取菌丝体压片，显微镜观察菌丝体形态。用无菌水冲洗菌落，制成孢子悬浮液，在载玻片中央滴一滴孢子悬浮液，用显微镜观察孢子形态[3，4]。

1.2.3 不同pH值对病菌生长的影响

将培养于PDA培养基中的病原菌打成直径为5 mm的菌饼，转接到pH值分别为2，4，6，8，10，12的PDA平板上，在28℃条件下培养相同时间，测量菌落生长直径，确定病菌的生长量[5]。

1.2.4 土壤pH对比试验

采用盆栽试验，初步探索种植大麻前后对土壤pH值的影响，在轻度盐碱地块取土，土壤pH为10.4，10次重复，每盆种植3株大麻，1个空盆不种大麻作为对照。大麻收获后，测量土壤pH的变化。

2 结果与分析

2.1 病菌的分离及纯化

从大麻产生病变的茎秆中分离得到3株真菌，经多代纯化后，回接至大麻植株，其中2株病菌对大麻植株具有较强的致病力，分别命名为DN1、DN2。将两株病菌分别利用针刺法回接到大麻植株上，植株5～7 d后出现感病症状。收集病变部位再次进行病原菌的分离，其病原菌在显微镜下与DN1、DN2一致。病菌在潮湿、高温的条件下容易导致植株发病，侵染茎秆初期，大麻茎秆出现不规则黄褐色斑块，且轮廓不明显，中心有黑色霉层，后期可导致茎秆弯曲、干枯，严重发病时导致茎秆折断。

图1 大麻茎腐病局部接种症状

2.2 病菌的形态观察

2.2.1 病菌菌落形态

分离得到的两株病原真菌菌落见图2。病原真菌DN1在PDA培养基中，在28℃条件下培养72 h，菌丝生长旺盛，放射状生长并形成规则的圆形菌落。另一株真菌命名为DN2，该真菌在PDA培养基中生长较为缓慢，需培养144 h，菌落开始为白色，培养一段时间后呈黄色，多为气生菌丝，菌落呈绒毛状突起。

图2 DN 1（a）和DN 2（b）的菌落形态

2.2.2 病菌菌丝及孢子形态观察

DN1菌丝及孢子形态见图3，其菌丝体长，生长旺盛，具有分节结构，分支较少。DN1具有非常强的产孢能力，在视野中能见到大量的淡褐色至深褐色、砖隔状的分生孢子，形状成卵圆形，顶端有喙状细胞。根据菌丝和孢子的形态特征可初步确定其为半知菌亚门真菌，链格孢属（Alternaria alternata）。[6]

图3 DN 1菌丝（a）及孢子（b）形态

DN2菌丝及孢子形态见图4，其菌丝体生长非常旺盛，不分节，分生孢子梗很短，在菌丝上成轮状分布。分生孢子小、单生、圆形且数量很大。由于其形态特征不是十分明显，初步推测其可能为半知菌亚门，轮枝孢属（M.Verticillium）[6]，应通过分子鉴定明确其所属门类。

图4 DN 2菌丝（a）及孢子（b）形态

2.3 不同pH值对病菌生长的影响

在PDA培养基上，对两种病原真菌在pH值为4，6，8，10，12，14条件下的生长情况进行测定，结果见图7、图8。从结果可以看出，菌株DN1具有更强的适应环境的能力，能够在更宽的pH范围内正常生长。两株菌在pH值低于4的条件下都不能生长，在pH值6～12的范围都生长良好。DN1的耐碱性明显强于DN2，pH值大于12以后，DN2的生长明显受到了抑制，而DN1仍表现出了较强的生长现象。

从两株病原真菌对pH值的适应性来看，病害的发生有着较宽的pH范围，对环境的适应能力很强。

表1 不同pH值菌株DN 1、DN 2的菌落生长直径

2.4 土壤pH对比试验

试验结果表明，大麻收获后，土壤的pH值有显著的变化，pH值降低的趋势较为明显。说明大面积种植大麻具有改良土壤碱性的潜力，其具体机制可对其根系微生物进行深入的研究，以便进一步开发大麻改善耕作土壤的能力。

表2 种植大麻后土壤pH值变化

3 结论与讨论

通过对病变组织的培养，分离并纯化得到两株病原真菌DN1和DN2，回接试验表明其对大麻有致病力。对两株病原真菌进行了形态学观察，通过菌落、菌丝及孢子的形态，初步确定DN1为半知菌亚门真菌，链格孢属（Alternaria alternata），DN2为半知菌亚门，轮枝孢属（M.Verticillium）。

两株病原真菌对pH值的适应性试验结果表明，两株病原真菌对pH值均有较强的适应能力，在pH值为4～12的环境下生长情况良好。其中，DN1对pH有更宽的适应能力，在pH值达到14时，仍具有一定的生长能力，说明病害的发生对环境具有很强的适应能力。

种植大麻后的土壤pH值发生了较为显著的变化，说明大麻具有改善碱性土壤的潜力，其纤维又具有很高的经济价值，因此大麻与粮食作物轮作，既可以改良土壤品质，又能够使农民增收，应对其改良土壤的机理进行进一步的深入研究。

[1]宋宪友，张利国，房郁妍，等.黑龙江省发展大麻的优势与主要栽培技术[J].中国麻业科学，2011，33（1）：27-30.

[2]关凤芝.大麻遗传育种与栽培技术[M].哈尔滨：黑龙江人民出版社，2010.

[3]沈萍，陈向东.微生物学实验[M].4版.北京：高等教育出版社，2007.

[4]庄新霞，江英，叶青任，等.小白杏软腐病病原菌的分离鉴定[J].食品工业，2011（6）：92-93.

[5]杨怀光，孟庆兰，王立芹，等.杨树肿干溃疡病病原菌的分离和鉴定[J].山东林业科技，2009（4）：31-35.

[6]邵力平，沈瑞祥，张素轩，等.真菌分类学[M].北京:中国林业出版社，1984.