嗜水气单胞菌拮抗芽孢杆菌抗菌素相关基因分析

曹海鹏，何 珊，王会聪，吕利群,*

(1.上海海洋大学国家水生动物病原库，上海 201306；2.江苏农林职业技术学院畜牧兽医系，江苏 句容 212400)

嗜水气单胞菌拮抗芽孢杆菌抗菌素相关基因分析

曹海鹏1，何 珊1，王会聪2，吕利群1,*

(1.上海海洋大学国家水生动物病原库，上海 201306；2.江苏农林职业技术学院畜牧兽医系，江苏 句容 212400)

分别对抗鲟源嗜水气单胞菌的解淀粉芽孢杆菌G1的抗菌素相关基因进行PCR扩增与测序，并对其编码产物的氨基酸序列、跨膜螺旋信号、结构域与二级结构等进行预测与分析。结果表明：菌株G1仅含有伊枯草菌素合成必需基因，该基因与GenBank基因库中芽孢杆菌属其他细菌的伊枯草菌素A、杆菌抗霉素D、抗霉枯草菌素等伊枯草菌素家族基因自然聚类，与枯草芽孢杆菌MH25株和RB14株的伊枯草菌素A基因16S rRNA序列有98%的高度同源性，而且其编码产物的氨基酸序列与GenBank中芽孢杆菌属其他细菌的伊枯草菌素、伊枯草菌素A、脂肽类化合物Bacillorin、芽孢菌素D等抗菌物质的氨基酸序列有高度同源性，与枯草芽孢杆菌MH25的伊枯草菌素A合成酶B(GenBank登录号：ABY89499)的亲缘关系最近。此外，菌株G1伊枯草菌素合成必需基因的编码产物不具有明显的跨膜结构，但其结构域中存在AMP结合位点和PP结合位点，二级结构中存在α螺旋、伸展链、β转角和无规则卷曲。

解淀粉芽孢杆菌；抗菌素相关基因；伊枯草菌素合成必需基因；系统发育分析

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是广泛存在于自然界的一种非致病性细菌，能够分泌抗生素、抗菌蛋白或多肽类物质而对多种病原菌、真菌、有害藻类、线虫等具有良好的抑制作用，是动植物病害生物防治的有效武器[1-4]。然而，国内外关于水产用解淀粉芽孢杆菌的研究却鲜见报道，仅曹海鹏等[5]对抗鲟源嗜水气单胞菌的解淀粉芽孢杆菌G1的抗菌特性、生长特性等生物学特性进行了研究，而对水产用解淀粉芽孢杆菌功能基因、发酵工艺、应用技术等其他方面的研究却仍处于空白状态。据报道，非核糖体途径合成的伊枯草菌素(iturin)、表面活性素(surfactin)等脂肽类抗生素是芽孢杆菌分泌的一类主要抗菌素，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种活性[6-7]；而核糖体途径合成的抗菌蛋白(TasA)则是另一种重要的功能蛋白，对多种动植物病原菌具有抑制活性[8]。这些抗菌活性物质均具有潜在的生物医药工程价值[9]。鉴于此，本实验在前期研究[5]的基础上，进一步对抗鲟源嗜水气单胞菌的解淀粉芽孢杆菌G1伊枯草菌素、表面活性素抗菌、抗菌蛋白等合成必需基因进行了检测与分析，以期在一定程度上确定菌株G1抗菌素相关基因分布的同时，为国内关于水产用解淀粉芽孢杆菌功能基因的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

解淀粉芽孢杆菌G1(B. amyloliquefaciens strain G1)，为本实验室分离的鲟源致病性嗜水气单胞菌拮抗菌株[5]。

1.2 引物设计

表 1抗菌素相关基因的扩增引物特性Table 1 Primers used for the amplif i cation of antibiotics related genes

1.3 解淀粉芽孢杆菌抗菌素合成必需基因的PCR检测与测序

将菌株G1接种到100mL无菌营养肉汤中，在200r/min、30℃条件下摇床振荡培养18～24h，然后用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒(细菌)提取菌株G1的基因组DNA，然后分别以基因组DNA为模板，采用PCR扩增试剂盒对抗菌蛋白合成必需基因、伊枯草菌素合成必需基因、表面活性素合成必需基因进行PCR检测[10]。扩增反应体系总体积25μL，包括DNA模板2μL，引物(10pmol/L)各1μL，dNTP(每份10mmol/L) 0.5μL，dUTP 0.5μL，10hPCR buffer 2.5μL，双蒸水17.0μL ExTaq DNA聚合酶(2.5U/μL)0.5μL。其中，抗菌蛋白合成必需基因、伊枯草菌素合成必需基因、表面活性素合成必需基因的PCR扩增条件为：95℃、5min，94℃、60s，61℃、60s，72℃、90s，共30个循环，最后一个循环结束后，72℃最终延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统下观察并拍照记录结果，并将PCR产物通过电泳并用DNA纯化回收试剂盒回收纯化后，委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。

1.4 解淀粉芽孢杆菌抗菌素合成必需基因序列比对分析

将菌株G1抗菌素合成必需基因片段的16S rRNA序列在美国国立生物技术信息中心(NCBI)中利用BLASTn软件与GenBank中已登陆基因的16S rRNA序列进行同源性比对，观察与相关基因16S rRNA序列的相似性。

1.5 解淀粉芽孢杆菌抗菌素合成必需基因编码产物的氨基酸序列分析

利用DNAMAN上的Open Reading Frame Search软件对菌株G1抗菌素合成必需基因片段编码产物的16S rRNA序列进行阅读框分析，预测编码的氨基酸序列，并进一步将预测的氨基酸序列在NCBI中利用BLASTn软件与GenBank中已登录蛋白质的氨基酸序列进行同源性比对，观察与相关蛋白氨基酸序列的相似性，并通过MEGA 4.0软件对菌株G1抗菌素合成必需基因编码产物的氨基酸序列与其他菌株蛋白氨基酸序列进行同源性比对分析后，利用邻接法构建系统发育树进行系统发育分析。

1.6 解淀粉芽孢杆菌抗菌素合成必需基因编码产物的跨膜螺旋信号分析

②提供与其他应用程序的服务接口，照标准格式协议，将预警数据与消息数据存放于数据库中，可供其他应用系统所读取调用。

利用米薇等[11]推荐的TMHMM 2.0在线软件(http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对菌株G1抗菌素合成必需基因片段编码产物的氨基酸序列进行跨膜螺旋信号分析。

1.7 解淀粉芽孢杆菌抗菌素合成必需基因编码产物的结构域与二级结构预测

用Pfam软件对菌株G1抗菌素合成必需基因片段编码产物的氨基酸序列进行结构域及蛋白家族预测，并用SOPM软件对其进行蛋白质二级结构预测。

2 结果与分析

2.1 菌株G1抗菌素合成必需基因的PCR检测与测序

图 1 菌株G1抗菌素合成必需基因的PCR扩增产物Fig.1 PCR amplif i cation of three genes essential for antibiotics synthetase of strain G1hetase essential gene of strain G1

由图1可知，仅菌株G1的伊枯草菌素合成必需基因扩增出一条大小为1.5kb的特异条带，其GenBank登录号为：JF751058，说明菌株G1含有伊枯草菌素合成必需基因，而不含抑菌蛋白合成必需基因、表面活性素合成必需基因。这与连玲丽等[10]关于拮抗芽孢杆菌EN4株和SW1株只含有伊枯草菌素合成基因的研究结果相同，但与Ramarathnam等[12]对蜡状芽孢杆菌(B.cereus)DFE4株、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)DFE16株和BS6株均含有表面活性素合成基因和伊枯草菌素A合成基因的实验发现不同，可能与菌株差异有关。

2.2 菌株G1伊枯草菌素合成必需基因核苷酸序列的比对

通过NCBI网站上BLASTn软件对菌株G1的伊枯草菌素合成必需基因片段16S rRNA序列与GenBank基因库中已有菌株基因的16S rRNA序列进行同源性比较结果(表2)表明，菌株G1伊枯草菌素合成必需基因与GenBank中枯草芽孢杆菌菌株的伊枯草菌素A、杆菌抗霉素D、抗霉枯草菌素等抗菌素合成相关基因自然聚类，其16S rRNA序列相似性高达81%～98%的，其中与枯草芽孢杆菌MH25株和RB14株的伊枯草菌素A基因16S rRNA序列的相似性最高。这与杜志兵等[13]关于拮抗芽孢杆菌菌株的伊枯草菌素A、伊枯草菌素B、伊枯草菌素C、伊枯草菌素D、抗霉枯草菌素等脂肽合成基因核苷酸序列具有高度同源性的观点相同，进一步证实了拮抗芽孢杆菌不同菌株之间的伊枯草菌素家族脂肽合成基因具有较高的同源性。

表 2 菌株G1伊枯草菌素合成必需基因与GenBank中已有细菌基因序列同源性比较Table 2 Comparison of gene sequence between the iturin synthetase essential gene of strain G1 and other related genes in GenBank

2.3 菌株G1伊枯草菌素合成必需基因编码产物的氨基酸序列分析

图 2 菌株G1伊枯草菌素合成必需基因编码产物的氨基酸序列Fig.2 Amino acid sequence of the encoded product of the iturin synthetase gene of strain G1

利用DNAMAN上Open Reading Frame Search工具对菌株G1伊枯草菌素合成必需基因片段的16S rRNA序列进行阅读框分析，预测相应的氨基酸序列如图2所示，其在GenBank上的登录号为：AEB21503。通过NCBI上BLASTn软件对该氨基酸序列与GenBank中已登录蛋白的氨基酸序列进行同源性比较结果表明，菌株G1伊枯草菌素合成必需基因编码产物的氨基酸序列与GenBank中芽孢杆菌属其他细菌的伊枯草菌素、伊枯草菌素A、脂肽类化合物Bacillorin、芽孢菌素D等抗菌物质的氨基酸序列有高度同源性。此外，通过邻接法构建的基于菌株G1伊枯草菌素合成必需基因编码产物氨基酸序列的系统发育树(图3)可以看出，菌株G1枯草菌素合成必需基因的编码产物与枯草芽孢杆菌MH25的伊枯草菌素A合成酶B(GenBank登录号：ABY89499)的亲缘关系最近。这与菌株G1伊枯草菌素合成必需基因核苷酸序列比对结果一致，进一步证实了菌株G1伊枯草菌素合成必需基因的系统进化关系。

图 3 通过邻接法构建的基于菌株G1伊枯草菌素合成必需基因编码产物的氨基酸序列的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on the amino acid sequence of the encoded product of the iturin synthetase gene of strain G1 using Neighbour-Joining method

2.4 菌株G1伊枯草菌素合成必需基因编码产物的跨膜螺旋信号分析

表 3菌株G1枯草菌素合成必需基因编码产物跨膜螺旋数据分析结果Table 3 Analysis of transmembrane heices of the encoded product of the iturin synthetase gene of strain G1

由表3可知，菌株G1伊枯草菌素合成必需基因编码产物的跨膜螺旋中的氨基酸残基数仅为0.49898，而且前60个氨基酸残基数为0.00033。根据跨膜蛋白判定标准[14]，即如果预测跨膜螺旋中的氨基酸残基数大于18，预测蛋白前60个氨基酸中跨膜螺旋中的氨基酸残基数有数个，则说明很有可能存在跨膜序列，而且蛋白N端可能存在信号肽，说明菌株G1伊枯草菌素合成必需基因编码产物不具有明显的跨膜结构，而且N端不存在信号肽。

2.5 菌株G1伊枯草菌素合成必需基因编码产物的结构域与二级结构预测

表 4 菌株G1伊枯草菌素合成必需基因编码产物的二级结构分析数据结果Table 4 Analysis of secondary structure of the encoded product of the iturin synthetase gene of strain G1

由表4可知，菌株G1伊枯草菌素合成必需基因编码产物的氨基酸共有475个，其结构域中存在AMP结合位点和PP结合位点，二级结构中存在α螺旋、伸展链、β转角和无规卷曲，其中有175个氨基酸参与形成无规卷曲，占所有氨基酸的36.84%；有155个氨基酸参与形成α螺旋，占所有氨基酸的32.63%；有107个氨基酸参与形成伸展链，占所有氨基酸的22.53%；仅有38个氨基酸参与形成β转角，占所有氨基酸的8.00%。显而易见，菌株G1伊枯草菌素合成必需基因编码产物的二级结构中具有相当稳定结构状态的α螺旋较少，因而其形态是多变的，这与张勤奋等[15]的观点相同。

3 结 论

菌株G1含有伊枯草菌素合成必需基因，该基因与枯草芽孢杆菌MH25株和RB14株的伊枯草菌素A基因16S rRNA序列具有较高的相似性，其编码产物的氨基酸序列与GenBank中芽孢杆菌属其他细菌的伊枯草菌素、伊枯草菌素A、脂肽类化合物Bacillorin、芽孢菌素D等抗菌物质的氨基酸序列也有高度同源性，因而推测菌株G1的抗菌作用与伊枯草菌素的产生有关，这与张桂英等[16]的研究结论相同。

本研究对菌株G1的伊枯草菌素合成必需基因进行了PCR扩增与测序，并对其编码产物的氨基酸序列、跨膜螺旋信号、结构域与二级结构等进行了预测与分析，填补了国内关于水产用解淀粉芽孢杆菌功能基因研究的空白，对深入研究菌株G1伊枯草菌素生物合成机制具有重要的意义。

目前，国外已经建立了伊枯草菌素的纯化鉴定技术[17-19]，并开展了其产生条件的研究[20]，但我国对此却鲜有研究。因此，将这些新技术与新成果有机地融入菌株G1伊枯草菌素的后续研究，无疑是创新菌株G1基础与应用研究的突破口，将极大地提高我国水产用拮抗芽孢杆菌的研究水平。

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Analysis of Antibiotics Related Genes from Antagonistic Bacillus amyloliquefaciens against Aeromonas hydrophila

CAO Hai-peng1，HE Shan1，WANG Hui-cong2，LÜ Li-qun1,*
(1. National Collection Centre for Aquatic Pathogens, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；2. Department of Animal Husbandry and Veterinary, Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry, Jurong 212400, China)

The antibiotics related genes of antagonistic Bacillus amyloliquefaciens G1 against Aeromonas hydrophila isolated from sturgeons were amplif i ed by PCR and sequenced. Meanwhile, the amino acid sequence, transmembrane heices, domains and secondary structure of their encoded products were determined. The results showed that only the gene essential for iturin synthetase was present in strain G1, which was naturally clustered with the iturin gene family from Bacillus sp. in GenBank, including iturin A, bacillomycin D, mycosubtilin, and showed 98% similarity to the iturin A gene sequences of B. subtilis strain MH25 and strain RB14. The amino acid sequence of the encoded product of the iturin synthetase gene exhibited high similarity to that of iturin, iturin A, bacillorin and bacillomycin D, and was close relative to the iturin A synthetase B of B. subtilis strain MH25 (GenBank accession No.ABY89499). In addition, no obvious transmembrane structure was present in the encoded product of the iturin synthetase gene of strain G1. However, both AMP-binding site and PP-binding site were present in its domains. Alpha helix, beta turn, random coil and extended strand were also present in its secondary structure.

Bacillus amyloliquefaciens；antibiotics related gene；iturin synthetase essential gene；phylogenetic analysis

Q939.97

A

1002-6630(2013)01-0171-04

2011-10-12

国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-46-12)；国家863计划项目(2011AA10A216)

曹海鹏(1981ü)，男，实验师，博士，研究方向为水产微生态制剂与病害生态防控。E-mail：hpcao@shou.edu.cn

*通信作者：吕利群(1971ü)，男，教授，博士，研究方向为水产动物病毒分子生物学。E-mail：lqlv@shou.edu.cn