SA-UPLC-MS-MS联用测定奶粉中双氰胺的残留量

张宪臣，王 勇，张朋杰，华洪波，李云松,*，李 蓉，李浩洋，杨 芳，卢俊文，谢思思

(1.中山出入境检验检疫局，广东 中山 528403；2.中山市外语外贸大学附设外语学校，广东 中山 528401)

SA-UPLC-MS-MS联用测定奶粉中双氰胺的残留量

张宪臣1，王 勇1，张朋杰1，华洪波2，李云松1,*，李 蓉1，李浩洋1，杨 芳1，卢俊文1，谢思思1

(1.中山出入境检验检疫局，广东 中山 528403；2.中山市外语外贸大学附设外语学校，广东 中山 528401)

建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS-MS)检测奶粉中双氰胺残留量的检测方法。以氘代试剂为内标，样品经氨化乙腈萃取后，平行定量浓缩仪浓缩，用正己烷脱脂，采用UPLC-MS-MS选择反应监测(SRM)正离子模式测定。双氰胺的检出限可达10☒g/kg，最低定量限可达50☒g/kg。在10～1000ng/mL范围内峰强度与质量浓度的线性关系良好(r＞0.990)。方法的平均回收率在99.6%～102.3%之间。方法简单、快速、稳定、准确、灵敏度高，能够满足日常工作中奶粉双氰胺的检测要求。

超高效液相色谱-串联质谱；平行定量浓缩仪；双氰胺；奶粉

双氰胺(二氰二氨，缩写DCD)，是氰胺的二聚体，因其氰基官能团能与硝化菌的巯基官能团结合而具有较好的硝化抑制效果。双氰胺可用作制取双氰胺化肥，双氰胺复合肥料可控制硝化菌的活动，使氮肥在土壤中的转化速度得到调节，提高肥料的使用效率[1-5]。双氰胺与酸反应，可制造各种胍盐[6-9]。双氰胺和苯基腈反应得到的苯代三聚氰二胺是涂料，层压板、成型粉的中间体，双氰胺还作为练漂剂用于纺织工业[10]。人吸入、摄入或经皮肤吸收后对身体有害。2013年1月，享誉全球的新西兰牛奶及奶制品被检测出含有低含量的有毒物质双氰胺，新西兰政府已经下令禁售含有双氰胺的奶类产品。该事件把双氰胺污染物推到了风口浪尖，现今国际标准未对奶粉中的双氰胺限量，国内也无对奶粉中双氰胺相关的检测标准和限量。由于双氰胺极性较强，很难吸附到普通的固相萃取柱，有机溶剂提取时极易发生蛋白沉淀，影响双氰胺的回收，因此奶粉中双氰胺的测定一直是检测机构研究的难点。

当前有关双氰胺的检测方法主要有阳离子交换法[11]、比色法、选择电极法、酶促法、pH值法、高效液相色谱法[12-16]、液质联用法[17-21]等。本实验采用平行定量浓缩仪-超高效液相色谱-串联质谱(syncore analyst-ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，SA-UPLC-MSMS)技术，依据其高灵敏度和选择性，建立了测定奶粉中双氰胺的方法。配方奶粉基质复杂，通常添加乳清蛋白、DHA、微量元素、维生素和某些氨基酸等成分，且双氰胺极性较强，因此使用普通的前处理方法被测组分损失较大，回收率低，难以达到正常的检测要求。本实验采用温水溶解奶粉，能够有效的克服蛋白沉降的问题；氨化乙腈提取，能够有效地提高被测组分的提取效率；冷冻离心除杂，能够有效地减少杂质的干扰；平行定量浓缩仪浓缩，能够有效地提高浓缩效率，方法简单、快速、准确、稳定、灵敏度高，适合于食品实验室大批量检测奶粉中双氰胺的残留量。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

进口奶粉样品(新西兰2012年12月产惠氏奶粉)由中山出入境检验检疫局食检科提供。

标准品：双氰胺(纯度大于99%) 天津Agela Technologies公司；双氰胺内标(纯度99.3%) 加拿大TRC公司；甲醇、乙腈、正己烷(色谱纯) 美国Fisher公司；甲酸(色谱纯) 上海晶纯实业有限公司；醋酸铵(色谱纯) 德国Merck公司；氨水(含量为25%～28%，优级纯) 广州化学试剂厂；无水硫酸钠(分析纯)。实验用水为Milli-Q水(蒸馏水经Millipore, Bedford, MA, USA产纯水机处理后的超纯水)。

TSQ Quantum超高效液相色谱与串联质谱联用仪(ESI源)、lcqun液相色谱-质谱工作站软件 美国Thermo Fisher Scientific公司；平行定量浓缩仪、B-740再循环冷却系统、V-700/701真空泵 瑞士Büchi公司；超声波清洗器 南京皓海科学仪器仪表有限公司；高速冷冻离心机 美国Beckman公司；0.25☒m水相滤膜 上海安普科技仪器有限公司；天平(感量0.1mg和0.001g)。

1.2 对照品溶液的配制

准确称取双氰胺对照品10mg(精确至0.01mg)，置于100mL容量瓶中，用体积分数50%乙腈溶液溶解，定容，摇匀，作为对照品储备液。

准确称取双氰胺内标对照品5mg(精确至0.01mg)，置于50mL容量瓶中，用体积分数50%乙腈溶液溶解，定容，摇匀，作为对照品储备液。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Agela Technologies Venusil HILIc柱(150mm×2.1mm，5☒m)；柱温：室温；进样量：10☒L；流动相：A为0.2mmol/L醋酸铵(用甲酸调pH值至4.0)，B为乙腈；梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1ble 1 Mobile phase compositon for gradient eluction

1.3.2 质谱条件

离子化模式：电喷雾离子(electrospray ionization，ESI)源，正离子模式；喷雾电压：4500V；鞘气流量：28L/min；辅助气流量：5L/min；离子传输管温度：350℃；扫描模式、定量和定性离子对、碰撞能量参数见表2。

表2 测定双氰胺和双氰胺内标的串联质谱参数Table2 MS-MS parameters for the determination of dicyandiamide and dicyandiamide-15N4

1.3.3 样品预处理

称取试样1.0g(精确到0.01g)于20mL带塞离心管中，加入40μL的内标标准工作液(5μg/mL)，涡旋混合30s，加入3.0mL 60℃温水涡旋1min，再加入7.0mL氨化乙腈涡旋1min，超声5min。以15000r/min(－10℃)冷冻离心15min。吸取上清液，用平行定量浓缩仪浓缩至干，以1.0mL起始流动相复溶，加入3mL正己烷涡旋混合1min，弃去上清液，再加入3mL正己烷涡旋混合1min，吸取下层溶液1.5mL置2mL离心管中，以14000r/min离心5min，弃上层液，取下层清液，经0.22μm有机相针式滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的优化

本研究最初选择固相萃取法对样品中的双氰胺进行提取净化，由于双氰胺极性较强，很难吸附到固相萃取小柱上，本实验使用Hypercarb、PCX(用于三聚氰胺前处理)、Pesticarb等SPE小柱进行净化，效果均不理想。

参考GB/T 22388—2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》中的前处理方法，最初选择使用三氟乙酸-水溶液(1:99，V/V)溶解奶粉，结果发现处理完样品溶液上机检测后，双氰胺的定量离子m/z 43.5被屏蔽掉，质谱无法检测到该碎片离子。本研究又选择常温条件下蒸馏水溶解奶粉，加入氨化乙腈后奶粉中蛋白迅速沉降，双氰胺回收率低于50%。把常温蒸馏水逐步升温至60℃温水溶解奶粉，缓慢加入氨化乙腈，样品中双氰胺回收率能够达到90%以上(图1)，误差范围为±5%。冷冻离心的时间也对样品中回收率有显著影响，离心时间越长，温度越低，检测图谱中杂质峰越少，双氰胺的回收率越高。在空白样品中进行加标回收实验，样品中加入50☒g/kg的双氰胺标准品(图2)，结果显示在－10℃条件下，15000r/min高速离心15min，双氰胺色谱峰能够达到基线完全分离，回收率可达到90%以上。

图1 水温对奶粉中双氰胺的回收率的影响Fig.1 Effect of water temperature on the recovery of dicyandiamide

研究发现提取溶液对双氰胺的回收率有较大影响，2%氨化乙腈的提取效果明显好于甲酸-乙腈(1:99，V/V)和乙腈的提取效果。由于氨化乙腈提取液沸点较高，用氮吹浓缩或旋转蒸发浓缩时间都比较长，且长时间高温会破坏氨化乙腈中双氰胺的稳定性，影响其回收率。本实验采用选择Buchi Syncore平行定量浓缩仪进行样品提取液的浓缩，并对浓缩的条件进行考察，确定浓缩温度为37℃；冷凝温度为0℃；真空度40mbar浓缩至干，该方法仅需1h就可以完全蒸干24份样品提取液。蒸干残渣加入样品定容溶液后采用正己烷脱脂和高速离心2次脱脂，得到澄清透明的样品溶液，完全满足质谱的净化要求。该处理方法样品的回收率均大于90%，并且能够同时批量处理样品，能够有效的降低检测成本，提高检测效率。

图2 不同温度和离心时间的双氰胺色谱图Fig.2 Chromatograms of dicyandiamide with high speed centrifugation for different time under different temperatures

2.2 色谱与质谱条件的确立

2.2.1 色谱条件优化

采用反相高效液相色谱法对样品中双氰胺进行分析，由于双氰胺极性较强，常规C18色谱柱对其保留很弱。双氰胺分子结构中带有氨基，本研究选择HILIC亲水柱对其进行色谱分离，分离效果非常理想。考虑到电喷雾电离模式为正离子模式(ESI+)，故在流动相中加入甲酸加强质子化效果。使用水和乙腈为流动相对双氰胺标准溶液进行分离，结果发现标准溶液响应重复性很差、峰展宽且拖尾严重。这是由于目标化合物质子化程度受流动相pH值影响严重而造成的，因此在流动相中引入缓冲盐，保持其相对稳定的酸度。考虑到HILIC柱对pH值的要求，最终选择pH4.0的0.2mmol/L乙酸铵缓冲盐和乙腈作为流动相。

2.2.2 质谱条件优化

在电喷雾正离子方式下对双氰胺和双氰胺内标进行一级质谱分析(Q1扫描)，得到分子离子，即母离子。对获得的离子峰进行二级质谱扫描，得到碎片信息，即子离子(图3)；优化碰撞能量和锥孔电压，确定最佳的质谱条件。由于双氰胺定量离子m/z 43.5在质谱扫描范围m/z (50～1500)最低限附近，因此方法优化前应对质谱进行调谐校正。

图3 双氰胺的二级质谱图Fig.3 MS-MS spectrum of dicyandiamide

2.3 方法的线性关系及灵敏度

准确量取适量的混合标准品储备工作液和同位素内标储备工作液，用乙腈-水(85:15，V/V)溶液稀释成质量浓度分别为10、50、100、200、500、1000☒g/L的标准品工作液。以双氰胺质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果显示双氰胺的质量浓度在10～1000☒g/L范围内线性关系良好，相关系数r＞0.9900，见表3。

检出限(LOD)和定量限(LOQ)采用向空白样品中逐级降低加标浓度的方法来确定。以3倍信噪比(RSN=3)对应的目标物含量为检出限，以RSN=10对应的目标物含量为定量限，获得奶粉中双氰胺的检出限(LOD)和定量限(LOQ)结果见表3。

表3 双氰胺的线性关系、检出限和定量限Table3 Linear relationship, LOD and LOQ for dicyandiamide

2.4 方法的准确度和精密度

在试样中进行3水平的添加回收实验，每个浓度平行作6个重复实验。在空白试样中双氰胺的回收率均在99.6%～102.3%之间，相对标准偏差(RSD)均在2.9%～8.2%之间(表4)。该方法的回收率和RSD均符合残留分析要求。

表4 样品加标回收率和相对标准偏差Table4 Recoveries and RSD for dicyandiamide in spiked sample

2.5 实际样品的检测

利用本研究建立的分析方法对新西兰进口30批不同品牌的奶粉进行检测，其中8批样品检出双氰胺。

3 结 论

采用氨化乙腈溶液提取，平行定量浓缩仪浓缩，用HILIC色谱柱进行色谱分离，建立了奶粉中双氰胺快速检测方法。方法检出限可达10☒g/kg，定量低限可达50☒g/kg，方法简单、快速、准确、重复性好、灵敏度高，适合于奶粉中双氰胺的检测。

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Determination of Dicyandiamide Residues in Milk by Syncore Analyst-Ultra Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Xian-chen1，WANG Yong1，ZHANG Peng-jie1， HUA Hong-bo2，LI Yun-song1,*，LI Rong1，LI Hao-yang1，YANG Fang1，LU Jun-wen1，XIE Si-si1
(1. Zhongshan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhongshan 528403, China；2. Zhongshan Foreign Language School Attached to Guangdong University of Foreign Studies, Zhongshan 528401, China)

A method for the determination of dicyandiamide in milk was developed by syncore analyst/ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (SA-UPLC-MS-MS). Deuterium substituted reagents were used as internal standards and added to the sample before extraction. The mixture was extracted with aminated acetonitrile, concentrated with syncore analyst, and cleaned up by hexane. The mass spectrometer was operated in the positive ion mode using select reaction monitoring for qualitative and quantitative analysis of dicyandiamide. The limit of detection (LOD) for dicyandiamide were 10 ☒g/kg, and limit of quantitation (LOQ) were 50 ☒g/kg. The correlation coefficient of the linear calibration curve was over 0.990 within the dicyandiamide concentration range 10–1000 ng/mL. The average recoveries for dicyandiamide were 99.6% to 102.3% (n = 6). The proposed method is simple, rapid, reliable, stable and sensitive. It can meet the requirements for the determination of dicyandiamide in milk.

ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS)；syncore analyst (SA)；dicyandiamide；milk

O658

A

1002-6630(2013)18-0231-04

10.7506/spkx1002-6630-201318047

2013-04-22

广东省自然科学基金项目(7301741)；中山市科技计划项目(20103A235；20123A272)；广东检验检疫局科技计划项目(2012GDK49)

张宪臣(1976—)，男，工程师，硕士，研究方向为食品中有害物质分析。E-mail：zhangxc@zs.gdciq.gov.cn

*通信作者：李云松(1976—)，男，工程师，硕士，研究方向为化学分析。E-mail：liys@zs.gdciq.gov.cn