响应面优化海藻酸钠回收马铃薯淀粉生产废水中蛋白质的工艺

刘婷婷，姚 佳，张飞俊，王大为*

(吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118)

响应面优化海藻酸钠回收马铃薯淀粉生产废水中蛋白质的工艺

刘婷婷，姚 佳，张飞俊，王大为*

(吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118)

采用海藻酸钠作为絮凝剂回收马铃薯淀粉废水中的蛋白质，并对其氨基酸组成进行分析。在单因素试验基础上，采用Box-Behnken试验设计与响应面分析方法，选取海藻酸钠添加量、pH值、絮凝温度、搅拌时间4个因素，以马铃薯蛋白质回收率作为响应值，优化海藻酸钠回收马铃薯淀粉废水中蛋白质的工艺参数。结果表明：海藻酸钠回收马铃薯蛋白质的最佳工艺参数为海藻酸钠添加量0.97g/L、絮凝温度35℃、搅拌时间35min、pH3.6，此条件下马铃薯蛋白质回收率为70.93%；氨基酸分析结果表明：回收的马铃薯蛋白质总氨基酸含量为69.43%，其中必需氨基酸含量为28.00%，占总氨基酸含量的40.33%，色氨酸为第一限制性氨基酸。

海藻酸钠；马铃薯淀粉；废水；蛋白质

马铃薯是世界上仅次于小麦、水稻和玉米的第4大粮食作物，我国马铃薯种植面积已达到670万公顷，约占世界总面积的25%，成为马铃薯生产第一大国[1-2]。我国马铃薯加工制品主要是淀粉类产品，加工过程中首先要分离出马铃薯淀粉，平均每生产1t马铃薯淀粉，需排放5t左右生产废水，废水中主要的成分是蛋白质，直接排放不但会造成资源浪费，还会带来环境污染问题[3-5]。马铃薯蛋白质是一种全价蛋白，营养价值优于大多数植物蛋白质，与牛奶蛋白和鸡蛋蛋白相当，功效比值(protein efficiency ratio，PER)达到2.3[6-7]，马铃薯蛋白质中2/3为球蛋白[8]，其氨基酸组成均衡，含有人体所需的8种必需氨基酸[9]，特别是赖氨酸含量较高，可以弥补谷物蛋白赖氨酸的缺乏。因此，回收马铃薯淀粉生产废水中的蛋白质，使其变废为宝，不仅可以解决马铃薯淀粉生产废水直接排放的污染问题，还可提高马铃薯的附加值，减少食物资源的浪费。

回收马铃薯淀粉生产废水中蛋白质的方法有泡沫分离法、膜分离法、加热絮凝法、絮凝剂法以及综合处理法等[10-13]。但利用海藻酸钠作为絮凝剂回收马铃薯淀粉生产废水中蛋白质的研究少见报道。海藻酸钠是一种天然高分子化合物类型的絮凝剂，其来源广泛，价格低廉，无毒无害，可供食用[14-16]。本研究以海藻酸钠作为絮凝剂回收废水中蛋白质，采用Box-Behnken试验设计与响应面分析方法优化海藻酸钠回收马铃薯蛋白质的工艺参数，为马铃薯淀粉废水的处理及其蛋白的回收利用提供科学依据与参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜马铃薯 市售。

海藻酸钠(食品级) 青岛明月海藻集团有限公司；牛血清蛋白(分析纯)、三羟基甲基氨基甲烷(分析纯)、甘氨酸(分析纯) 上海惠世生化试剂有限公司；考马斯亮蓝R-250(分析纯) 北京鼎国生物技术有限责任公司；硫酸、硫酸铜、三羟基甲基氨基甲烷、过硫酸铵、β-巯基乙醇等均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

MJ-60BE01B型组织捣碎机 美的生活电器有限公司；GB1302电子精密天平、SPN402F电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；CT15RT型高速冷冻离心机上海天美科学仪器有限公司；IT-09A-5恒温磁力搅拌器上海一恒科技有限公司；PHS-3BW型电脑数显酸度计上海理达仪器厂；TV-1901紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；L-8800全自动氨基酸分析仪 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 模拟马铃薯淀粉生产废水的制备

将马铃薯洗净，切块，按马铃薯与水2∶1(质量比)的比例加水，同时加入NaHSO3(0.1g/kg)，在组织捣碎机中捣碎成浆，静置15min后，用滤袋过滤，除去马铃薯渣，滤液在4000r/min转速离心10min，上清液即为模拟马铃薯生产淀粉废水[17]。

1.3.2 海藻酸钠回收马铃薯淀粉废水中蛋白质

准确量取100mL马铃薯淀粉废水于250mL的烧杯中，加入海藻酸钠并调节pH值，用磁力搅拌器以300r/min的速度搅拌一定时间后，在4500r/min转速离心15min，离心沉淀所得即回收的马铃薯蛋白质。

1.3.3 蛋白质含量的测定

废水中蛋白质含量的测定：采用双缩脲法[18]测定；回收马铃薯蛋白质含量的测定：采用GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白质的测定》方法测定。

1.3.4 马铃薯蛋白质回收率计算

式中：m1为马铃薯淀粉生产废水中蛋白质质量/g；m2为回收马铃薯蛋白质后废水中蛋白质质量/g。

1.3.5 单因素试验

1.3.5.1 海藻酸钠添加量对马铃薯蛋白质回收率的影响

以马铃薯蛋白质回收率作为考核指标，在絮凝温度35℃、搅拌时间30min、pH3.5的条件下，研究海藻酸钠添加量0.3、0.5、0.7、0.9、1.1g/L对马铃薯蛋白质回收率的影响。

1.3.5.2 絮凝温度对马铃薯蛋白质回收率的影响

以马铃薯蛋白质回收率作为考核指标，在海藻酸钠添加量0.9g/L、搅拌时间30min、pH3.5的条件下，研究絮凝温度25、30、35、40、45、50℃对马铃薯蛋白质回收率的影响。

1.3.5.3 搅拌时间对马铃薯蛋白质回收率的影响

以马铃薯蛋白质回收率作为考核指标，在海藻酸钠添加量0.9g/L、絮凝温度35℃、pH3.5的条件下，研究搅拌时间10、20、30、40、50min对马铃薯蛋白质回收率的影响。

1.3.5.4 pH值对马铃薯蛋白质回收率的影响

以马铃薯蛋白质回收率作为考核指标，在海藻酸钠添加量0.9g/L、絮凝温度35℃、搅拌时间30min的条件下，研究pH2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0对马铃薯蛋白质回收率的影响。

1.3.6 响应面优化试验

在单因素的基础上，以海藻酸钠添加量、絮凝温度、搅拌时间、pH值为试验因素，以马铃薯蛋白质回收率为响应值，进行响应面优化试验。采用Design Expert 8.0.6统计软件，进行Box-Behnken设计及响应面分析试验。试验因素水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素及水平表Table1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.7 SDS-PAGE测定回收马铃薯蛋白质的相对分子质量

采用SDS-PAGE法[18]对马铃薯蛋白质的相对分子质量进行测定，配制15%分离胶和5%浓缩胶，采用稳定电压操作，浓缩胶电压80V，分离胶电压120V。电泳结束后，采用考马斯亮蓝R-250对其染色。以标准蛋白质分子质量的对数绘制相对迁移率的标准曲线，并计算出回收马铃薯蛋白质的相对分子质量。

1.3.8 回收马铃薯蛋白质的氨基酸组分分析

16种氨基酸测定：按照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》方法测定；色氨酸含量测定：按照GB/T 7650—1987《谷物不溶性膳食纤维测定》方法测定。

4.5 严格无菌操作 神经移位手术无菌技术的要求比一般手术更为严格。因为一般组织比神经组织对感染的防御能力强［3］。一旦手术感染，将对患者带来严重后果。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 海藻酸钠添加量对马铃薯蛋白质回收率的影响

图1 海藻酸钠添加量对马铃薯蛋白质回收率的影响Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on the recovery rate of protein

由图1可知，随着海藻酸钠添加量的增加，马铃薯蛋白质回收率逐渐增大，当海藻酸钠添加量为0.9g/L时，其回收率达到最大值，当海藻酸钠添加量继续增加时，其回收率有所下降。絮凝效果一般随絮凝剂的添加量增加而增强，海藻酸钠与蛋白质产生相互作用，使蛋白质沉淀下来，提高了蛋白质的回收率，但絮凝剂添加过量时，会使已经形成的絮体重新变成稳定的胶体[16]，影响絮凝效果。因此，海藻酸钠添加量以0.9g/L为宜。

2.1.2 絮凝温度对马铃薯蛋白质回收率的影响

图2 絮凝温度对马铃薯蛋白质回收率的影响Fig.2 Effect of flocculation temperature on the recovery rate of protein

由图2可知，随着絮凝温度的升高，马铃薯蛋白质回收率达到最高值后开始下降。温度为35℃时，其回收率达到最大值。絮凝温度过低或过高都会影响回收效果，当絮凝温度过低时，絮凝体的黏度下降，破坏海藻酸钠已经形成的胶团，增加了水体对絮凝体的剪切作用，使絮凝体变得细小，不容易分离。絮凝的温度过高时，虽然可以加快化学反应速度，但也会形成细小的絮凝体，影响分离效果。因此，絮凝温度以35℃为宜。

2.1.3 搅拌时间对马铃薯蛋白质回收率的影响

图3 搅拌时间对马铃薯蛋白质回收率的影响Fig.3 Effect of stirring time on the recovery rate of protein

2.1.4 pH值对马铃薯蛋白质回收率的影响

图4 pH值对马铃薯蛋白质回收率的影响Fig.4 Effect of pH on the recovery rate of protein

由图4可知，pH值对马铃薯蛋白质回收率有较为显著的影响。随着pH值的增大，废水的黏度不断增大[19]，废水中蛋白质所带电荷的性质和数量发生改变，使海藻酸钠与蛋白质之间发生相互作用[20]，马铃薯蛋白质回收率迅速增大。但pH值继续增大时，其回收率反而下降。当pH值为3.5时，絮凝效果较好，絮凝作用完全。选择合适的pH值，不但影响絮凝效果，而且可节省大量的絮凝剂，从而降低了成本。因此，以pH3.5为宜。

2.2 响应面分析

2.2.1 模型的建立及显著性检验

Box-Behnken试验设计方案及结果见表2，利用Design Expert 8.0.6软件对表2试验数据进行二次多元回归拟合，得到马铃薯蛋白质回收率(Y)对海藻酸钠添加量(A)、絮凝温度(B)、絮凝时间(C)、pH值(D)4个因素的二次多项式回归模型为：

Y=69.00＋5.49A-1.86B＋5.06C＋2.40D＋1.52AB-3.11AC-1.09AD＋1.80BC＋1.13BD＋1.56CD-5.35A2-7.19B2-4.76C2-5.60D2

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table2 Box-Behnken design and results

表3 响应面试验方差分析Table3 Analysis of variance for the fitted response surface model

由表3可以看出，模型P=0.0001＜0.01，表明回归模型达到显著水平，失拟项P=0.0863＞0.05，表明模型失拟项不显著。模型的R2=98.89%，表明该模型与实际拟合较好，可以用此模型来分析和预测海藻酸钠絮凝马铃薯淀粉废水中蛋白质工艺参数。方差分析结果显示，A、B、C、D、AC、BC、A2、B2、C2、D2达到极显著水平，AB、CD达到显著水平，各因素对马铃薯蛋白质回收率的影响次序为：海藻酸钠添加量＞搅拌时间＞pH值＞絮凝温度。

2.2.2 各因素的交互作用对马铃薯蛋白质回收率的影响

根据回归方程绘出响应面及等高线图，如图5所示。可以直观的看出各因素及其交互作用对马铃薯蛋白质回收率的影响。等高线的形状可反映出交互效应的强弱。椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。

图5 两因素交互作用的响应曲面及等高线图Fig.5 Response surface and contour plots showing the interaction effects of process parameters on the recovery rate of protein

通过Design Expert软件分析得到，利用海藻酸钠作为絮凝剂回收马铃薯蛋白质的最佳工艺参数为海藻酸钠添加量0.97g/L、絮凝温度34.91℃、搅拌时间34.52min、pH3.62，此时马铃薯蛋白质回收率为71.42%。考虑到实际生产及可操作性，将最优工艺参数定为：海藻酸钠添加量0.97g/L、絮凝温度35℃、搅拌时间35min、pH3.6。

2.2.3 验证实验

为了验证预测结果，按优化工艺参数进行重复实验，重复3次，测定结果取平均值，得到马铃薯蛋白质回收率为70.93%，与预测值基本相符，表明响应面法得到的絮凝工艺参数准确可靠，具有实用价值。与盐溶酸沉法[3]、酸热法[21]、碱提酸沉法[17]等方法相比，本研究方法回收马铃薯蛋白质收率较为理想。

2.2.4 回收马铃薯蛋白质的相对分子质量测定结果

由图6标准蛋白质的迁移距离，计算标准蛋白质的相对迁移率Rf，绘制标准蛋白质相对迁移率Rf与其分子质量对数lg(Mw)的关系，即标准蛋白分子质量的标准曲线，得到回归方程为：y=-1.6867x＋2.143，R2=0.9817。由图6可以看出，1泳道中出现6条主带，计算出马铃薯蛋白质分子质量分别为42.66、38.43、23.08、22.02、18.55、16.48kD。除6条主带外，还有分子质量在76.91、66.01、57.99、9.94kD的浅带。

图6 马铃薯蛋白质SDS-PAGE电泳图谱Fig.6 SDS-PAGE of the recovered protein

2.2.5 回收马铃薯蛋白质氨基酸组成

图7 马铃薯蛋白质16种氨基酸图谱Fig.7 Chromatogram of sixteen amino acids in the recovered protein

图8 色氨酸标准图谱及马铃薯蛋白质图谱Fig.8 Chromatograms of tryptophan standard and the recovered protein

由图7、8和表4可知，采用海藻酸钠回收马铃薯淀粉废水中蛋白质的含量为72.08%。马铃薯蛋白质中分离出17种氨基酸，其必需氨基酸含量为28.00%，非必需氨基酸含量为41.43%，其中，必需氨基酸中色氨酸含量较低，色氨酸为马铃薯蛋白粉的第一限制性氨基酸。马铃薯蛋白质必需氨基酸含量占总氨基酸含量的40.33%，必需氨基酸与非必需氨基酸含量的比值为0.68，其分别高于WHO/FAO标准规定的40%和0.6，大豆蛋白38.5%和0.56[21]，除此之外，马铃薯蛋白质还含有较高的赖氨酸，赖氨酸是谷物蛋白质第一限制性氨基酸，马铃薯蛋白可弥补谷物蛋白的缺陷。

表4 马铃薯蛋白质氨基酸组分Table4 Amino acid composition of the recovered protein

3 结 论

采用Box-Behnken设计，建立海藻酸钠回收马铃薯蛋白质工艺参数的二次多项式数学模型，经检验该模型是合理的，能够较好的预测马铃薯蛋白质的回收率。在利用海藻酸钠回收马铃薯蛋白质的过程中，各因素对马铃薯蛋白质回收率影响主次顺序依次为海藻酸钠添加量＞搅拌时间＞pH值＞絮凝温度，所得最佳工艺参数为海藻酸钠添加量0.97g/L、絮凝温度35℃、搅拌时间35min、pH3.6，马铃薯蛋白质回收率为70.93%。利用氨基酸自动分析仪测定海藻酸钠回收马铃薯蛋白质的氨基酸组分，实验证明，回收的马铃薯蛋白质总氨基酸含量为69.43%，必需氨基酸含量为28.00%，占总氨基酸含量的40.33%，优于大豆蛋白，其第一限制性氨基酸为色氨酸，此外，马铃薯蛋白质赖氨酸含量较高，可以弥补谷物蛋白赖氨酸缺乏。

[1] 齐斌, 郑丽雪, 朴金苗. 马铃薯分离蛋白的提取工艺[J]. 食品科学, 2010, 31(22): 297-300.

[2] 孙东升, 刘合光. 我国马铃薯产业发展现状及前景展望[J]. 农业展望, 2009(3): 25-28.

[3] 金虹. 马铃薯淀粉生产废液中蛋白质提取工艺的优化[J]. 湖北农业科学, 2011(12): 2516-2518.

[4] 黄峻榕, 高洁, 龚频, 等. 马铃薯淀粉废水中蛋白质回收方法的研究进展[J]. 食品科技, 2012, 37(2): 89-97.

[5] 任燕, 秦礼康. 马铃薯淀粉加工汁水蛋白的臭氧鼓泡分离及营养评价[J]. 食品工业科技, 2011, 32(2): 223-227.

[6] HAASE N U. Healthy aspects of potatoes as part of the human diet[J]. Potato Research, 2008, 51(3/4): 239-258.

[7] KAMNERDPETCH C, WEISS M, KASPER C, et al. An improvement of potato pulp protein hydrolyzation process by the combination of protease enzyme systems[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2007, 40(4): 508-514.

[8] 马莺, 顾瑞霞. 马铃薯深加工技术[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 2003: 10-13.

[9] PASTUSZEWSKA B,TUSNIO A, TACIAK M, et al. Variability in the composition of potato protein concentrate produced in different starch factories-apreliminary survey[J]. Animal Feed Science and Technology, 2009, 154(3/4): 260-264.

[10] ☒☒RKA E, POUR V, VESEL☒ A, et al. Possibilities for the use of membrane processes for the pre-treatment of wastewater from the production of dried potato purée[J]. Desalination, 2009, 249(1): 135-138.

[11] VIKELOUDA M, KIOSSEOGLOU V. The use of carboxymethylcellulose to recover potato proteins and control their functional properties[J]. Food Hydrocolloids, 2004, 18(1): 21-27.

[12] 陈钰, 潘晓琴, 钟振声, 等. 马铃薯淀粉加工废水中超滤回收马铃薯蛋白[J]. 食品研究与开发, 2010, 31(9): 37-41.

[13] 张轶, 杨大林, 韩杰, 等. 磁性壳聚糖微球吸附马铃薯淀粉废水中蛋白的应用研究[J]. 食品工业科技, 2010, 31(9): 251-253.

[14] 郭素容, 刘栋, 蒋大和. 新型天然海藻絮凝剂处理食品废水的研究[J].工业水处理, 2006, 26(9): 25-29.

[15] 徐晓军. 化学絮凝剂作用原理[M]. 北京: 科学出版社, 2005: 175-189.

[16] 张文娟, 徐珊珊. 用海藻制备絮凝剂处理蛋白废水的研究[J]. 山东科学, 2007, 20(1): 34-41.

[17] 任琼琼, 陈丽清, 韩佳冬, 等. 马铃薯淀粉废水中蛋白质的提取研究[J].食品工业科技, 2012, 33(14): 284-287.

[18] 张建社, 褚武英, 陈韬. 蛋白质分离与纯化技术[M]. 北京: 军事医学科学出版社, 2009: 88-90.

[19] 肖锦, 周勤. 天然高分子絮凝剂[M]. 北京: 化学工业出版社, 2005: 232-239.

[20] 武玉学, 靳挺, 王建平, 等. 天然海藻絮凝剂海藻酸钠回收带鱼鱼糜漂洗液中蛋白质的研究[J]. 海洋与湖沼, 2012(2): 335-339.

[21] 吕文博, 王三反, 石金晔, 等. 从马铃薯淀粉废水中提取饲料蛋白的研究[J]. 工业安全与环保, 2009, 35(7): 9-10.

[21] 赵江, 张泽生, 王浩, 等. 蛋白粉中乳清浓缩蛋白和大豆分离蛋白的复配及其营养价值评价[J]. 食品研究与开发, 2007, 28(9): 145-147.

Application of Response Surface Methodology to Optimize Extraction of Protein from Potato Starch Wastewater by Sodium Alginate

LIU Ting-ting，YAO Jia，ZHANG Fei-jun，WANG Da-wei*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Sodium alginate was used as a natural polymer flocculant to recover protein from potato starch wastewater. In addition, the amino acid composition of the recovered protein was analyzed. Box-Behnken design coupled with response surface analysis was used to optimize four variables for recovering protein including sodium alginate dosage, pH, temperature and stirring time. The optimal process conditions of the variables were found to be stirring with 0.97 g/L sodium alginate at pH 3.6 for 35 min at 35 ℃, resulting in a protein recovery of 70.93%. The total amino acid content of the recovered protein was 69.43% and the ratio of essential amino acids to total amino acids was 40.33%. Tryptophane was the first limiting amino acid.

sodium alginate；potato starch；wastewater；protein

X703

A

1002-6630(2013)18-0075-07

10.7506/spkx1002-6630-201318016

2013-04-01

长春市科技发展计划项目(长科技合2011191)；吉林省科技成果转化补助项目(20115016)

刘婷婷(1984—)，女，讲师，博士，研究方向为粮食、油脂与植物蛋白工程。E-mail：ltt1984@163.com

*通信作者：王大为(1960—)，男，教授，博士，研究方向为粮食、油脂与植物蛋白工程及功能食品。E-mail：xcpyfzx@163.com