高压CO2处理钝化香蕉果肉多酚氧化酶的动力学

汪少华，余元善，徐玉娟,*，肖更生，吴继军，唐道邦，曹清明

(1.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东 广州 510610；2.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004)

高压CO2处理钝化香蕉果肉多酚氧化酶的动力学

汪少华1,2，余元善1，徐玉娟1,*，肖更生1，吴继军1，唐道邦1，曹清明2

(1.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东 广州 510610；2.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004)

研究影响高压CO2处理钝化香蕉果肉多酚氧化酶的因素，并应用两段模型分析了高压CO2处理对香蕉果肉多酚氧化酶的钝化动力学。结果表明：CO2压力、处理温度、处理时间和样品pH值都能显著影响高压CO2处理钝化香蕉果肉多酚氧化酶的效率；高压CO2处理对香蕉果肉多酚氧化酶的钝化过程符合两段模型；高压CO2处理能有效的钝化香蕉果肉多酚氧化酶，提高CO2压力和处理温度、延长处理时间和适当降低样品的pH值都能显著增强高压CO2处理钝化酶的速率；20MPa、55℃的高压CO2处理40min后能钝化83.5%的香蕉果肉多酚氧化酶，当温度升到60℃，20 MPa的高压CO2处理时，20min处理后仅残留有4.2%的多酚氧化酶活力。

高压CO2；香蕉果肉；多酚氧化酶；钝化

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是含有铜离子的氧化酶，根据催化底物特异性一般包括单酚氧化酶(tyrosinase)和邻苯二酚氧化酶(catechol oxidase)[1]。广泛分布在各种植物组织中，能催化植物组织中的多种酚类氧化成褐色的醌类物质。在食品加工中，由于植物组织的损坏，使多酚氧化酶能有效的与底物(氧气和酚类物质)结合，导致酶促褐变的发生，对产品的感官营养特性，特别是消费者接受性带来不利的影响[2-3]。香蕉属于热带/亚热带气候地区种植的主要经济作物，在我国广东、广西和海南等省也有大面积种植[4-5]。香蕉果肉中含有丰富的营养物质不仅可以鲜食，还可以加工成其他多种产品，如香蕉淀粉(抗性淀粉)、香蕉粉(婴幼儿奶粉添加剂)、香蕉脆片(休闲食品)、香蕉汁、香蕉酒和香蕉醋等。香蕉果肉和果皮中含有丰富的多酚氧化酶和酚类物质，在食品加工中，特别是前处理阶段，怎样防止香蕉产品酶促褐变是一个非常棘手的问题。为了抑制褐变，传统的方法是通过热加工或一些化学护色剂(柠檬酸、亚硫酸盐和抗坏血酸等)来钝化或抑制香蕉果肉多酚氧化酶活力。热加工易使产品产生蒸煮味，并对香蕉中的营养成分破坏较大，而护色工艺本身不能完全钝化香蕉多酚氧化酶，且护色剂的添加容易产生一系列的食品安全问题，对产品的风味也有一定的影响[5-6]。因此，寻找新的加工方法来钝化香蕉果肉多酚氧化酶，并减少对其营养成分的破坏，是提高香蕉加工产品品质，实现高附加值的有效途径。

高压CO2技术是目前发展较快的一种新型的非热加工技术，它克服了热加工造成的种种弊端[7-8]。研究表明，在一定的压力下(3～30MPa)，CO2对食品中微生物具有杀灭效果，同时能使部分酶钝化。目前，关于高压CO2技术对食品中微生物的灭菌效果研究较多，但对食品内源酶钝化作用的研究相对较少。几项研究表明，高压CO2技术处理能有效降低多种酶的活性，并认为酶活性的降低与酶二级结构中α-螺旋结构变化有关[9-11]。Ishkawa等[12]发现，在25MPa、35℃、30min的超临界CO2的处理下，脂肪酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶以及葡萄糖氧化酶的活性分别为处理前的62.9%、31.3%、37.6%、12.4%，同时观察到处理后α-螺旋结构发生了变化，可能是这种变化导致了酶活性的变化。

酶钝化动力学模型是根据钝化随时间变化效果的数学描述，来反应酶的稳定性和多样性以及自身对处理条件的敏感性。根据对酶钝化的研究文献看，一般有一级动力学模型、部分转化模型和两段式模型[13-15]。不同种类和来源的酶钝化过程差异较大。目前，高压CO2对香蕉果肉多酚氧化酶的钝化动力学仍未见报道。

本实验研究影响高压CO2钝化香蕉果肉多酚氧化酶的因素，并且分析了高压CO2对香蕉果肉多酚氧化酶的钝化动力学，旨在为高压CO2技术在香蕉加工中的酶促褐变控制提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

香蕉 属于广州本地蕉品种(七八成熟，黄绿色)，购自广州当地超市。

99.5 %二氧化碳气体 广州龙奥气体设备有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

处理设备流程图Fig.1 Flow chart of high pressure carbon dioxide processing equipment图1 高压CO2

打浆机 美的集团公司；高速分散均质机 上海标本模型厂；紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；高压CO2处理设备(图1是该设备流程图) 杭州华磊泵业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 香蕉果肉多酚氧化酶液的制备

将购买的香蕉去皮，将果肉切成1cm长的小段；100g果肉与250mL的0.1mol/l磷酸钠盐缓冲液体(pH 5.5)混合，同时添加3.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)和3.5mL Triton X-100；放置在打浆机中中速处理3min后，转入500mL烧杯中高速均质5min；将上述均质后的样品于4℃条件下10000×g离心10min，上清液即是香蕉果肉多酚氧化酶的粗酶液(pH5.45)。

另外，使用2mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节上述香蕉果肉多酚氧化酶的粗酶液，获得不同pH值的粗酶液(pH值在3.5～7.5之间)，以供样品的pH值对高压CO2处理钝化香蕉果肉多酚氧化酶的影响研究。

1.2.2 样品高压CO2处理方法

取200mL香蕉果肉多酚氧化酶的粗酶液置于高压CO2装置的样品釜中，调节样品釜的温度和CO2的压力到设定值(2～3min)，恒温恒压保持设定的时间后，缓慢释放CO2到正常大气压(3～4min)，取出样品并立即将其置于冰浴中短暂贮藏，用于分析样品中残留的多酚氧化酶活力。以不充CO2的样品处理为正常大气压对照，结果以相对残留酶活力表示。

1.2.3 多酚氧化酶活力测定方法

多酚氧化酶活力测定采用邻苯二酚法[16]。具体为：0.5mL 50mmol/L邻苯二酚水溶液、 2mL 50mmol/L的磷酸钠盐缓冲液(pH 7.0)和20μL待测样品酶液充分混合，反应体系温度为30℃，立即置于分光光度计中，测定并监控OD420nm值的变化，以每分钟ΔOD420nm变化0.001所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

1.2.4 酶失活动力学模型和数据公式

一级动力学模型常用于酶失活动力学分析，酶失活率与处理时间成正比(式2)。

式中：A0为处理前酶活力/U；A为处理后酶活力/U；t为处理时间/min；k为给定温度和CO2压力下的失活速率/min-1。

如果发现结果不符合一级动力学模型时，可采用两段模型，该模型包含了快速钝化期和缓慢钝化期两段(式3)，一般有同工酶存在时使用此模型。

式中：AL和As分别为快速钝化期和缓慢钝化期的初始酶活力/U；kL和kS分别为分别为快速钝化期和缓慢钝化期的反应速率常数/min-1；A为处理后酶活力/U；t为处理时间/min。

在酶钝化失活过程中，当只有敏感性部分被钝化，而稳定性部分酶活保持不变时，一般采用部分转化模型(式4)。

式中：A为处理后酶活力/U；t为处理时间/min；A0和A∞为处理前酶活力和不变酶活力/U；k为反应速率常数/min-1。

其他相关公式有：

式中：D值指给定条件下，酶活力达到90%失活所需要的时间/min；ZP和ZT表示D值对压强(MPa)和温度(℃)的敏感性，指D值减少90%时对应的压力和温度的各自需要的增加量；P1和P2表示D1和D2对应的压强/MPa；T1和T2表示D1和D2对应的温度/℃。

温度对酶钝化反应的影响用Arrhenius公式分析。活化能Ea(kJ/mol)表示温度对反应常数k的影响；T2和T1表示对应k1和k2的绝对温度/K；R是气体常数(8.314J/kmol)。

2 结果与分析

2.1 正常大气压下温度对香蕉果肉多酚氧化酶钝化动力学的影响

表1 香蕉果肉多酚氧化酶粗酶液经常压温热处理后的相对残留酶活力Table1 Relative residual activity of crude PPO from banana pulp after mild thermal treatment under atmospheric conditions %

在温热处理下(正常大气压，温度为30～60℃)，随着处理温度和时间的延长，香蕉果肉多酚氧化酶的酶活力有明显的减少(P＜0.05)。此外，结果也表明香蕉果肉多酚氧化酶具有较强的耐热性，香蕉果肉粗酶液(pH5.45)在60℃处理80min后，仍残留有83.1%的酶活力(表1)。大部分酶的热失活符合一级动力学模型，将表1中的数据带入公式(2)和公式(5)～(7)，分别估算出香蕉果肉多酚氧化酶在常压30、40、50、55、60℃处理下的D值分别为1976.6、1730.4、 1270.4、 1036.9 、995.2min，并且也可以推算出其ZT值为100.7℃(R2=0.974)。

2.2 高压CO2处理压力对香蕉果肉多酚氧化酶钝化动力学的影响

图2 香蕉果肉多酚氧化酶在55℃经高压CO2处理后的相对残留酶活力Fig.2 Relative residual activity of crude PPO from banana pulp exposed to high pressure carbon dioxide at 55 ℃

由图2可以看出，香蕉果肉多酚氧化酶55℃高压CO2处理的失活特性明显不同于常压55℃处理，高压CO2处理能显著提高香蕉果肉多酚氧化酶的失活率，并且一级失活模型不能很好的表征香蕉多酚氧化酶在高压CO2处理下的失活特性。香蕉果肉多酚氧化酶在高压CO2处理下呈现快速钝化期和缓慢钝化期两个阶段，它们适合用两段模型来表征。

表2 香蕉果肉多酚氧化酶在55 ℃、高压CO2处理条件下的钝化动力学参数(两段模型估算)Table2 Kinetic parameters for PPO from banana pulp exposed to high pressure carbon dioxide at 55 ℃(estimated by two-fraction model)

从表2可知，在15MPa以下时，随着CO2压力的提高，香蕉果肉多酚氧化酶在快速钝化期的失活率也显著的快速提高，而在15MPa以上时，CO2压力的提高对香蕉果肉多酚氧化酶的失活速率影响不显著(P＞0.05)。很多研究认为，高压CO2的钝酶机制与超高压的钝酶机制是完全不一样的。超高压钝化酶是通过高静力压(100MPa以上)的作用来诱导酶的结构发生改变而失活，随着压力的增加，酶的失活速率明显增大，而在高压CO2处理钝酶过程中，压力一般较低(低于50MPa)，单独的压力作用不能够导致酶的失活[14-17]。本研究也发现，在15MPa以上时，CO2压力的提高对香蕉果肉多酚氧化酶的失活速率影响不显著，这说明压力不是导致高压CO2失活的主要原因。Meyssami 等[17]认为，在高压CO2钝酶过程，溶解于样品中CO2与水结合形成碳酸，使样品溶液的pH值降低才是导致酶失活的主要原因；在高压CO2处理中，当处理条件达到CO2的超临界点后，压强的增加不会导致超临界CO2的密度明显增加，也就不会导致体系pH值的继续降低，从而也就不会影响灭酶效率。

2.3 高压CO2处理温度对香蕉果肉多酚氧化酶钝化动力学的影响

(20MPa)处理钝化香蕉果肉多酚氧化酶的影响Fig.3 Effect of temperature on inactivation of PPO from banana pulp treated by high pressure carbon dioxide at 20 MPa图3 温度对高压CO2

图3 是20MPa条件下，不同温度对高压CO2钝化香蕉果肉多酚氧化酶的效果。与常压条件下同等温度钝化香蕉果肉多酚氧化酶的结果相比(表1)，高压CO2处理明显增强了多酚氧化酶的钝化效果。不同温度条件下，高压CO2(20MPa)处理对香蕉果肉多酚氧化酶的钝化动力学明显适合用部分转换模型来表征。温度的提高能显著增加高压CO2处理对香蕉果肉多酚氧化酶的钝化效果，在60℃条件下高压CO2处理多香蕉多酚氧化酶快速钝酶期的酶失活率是30℃条件下的140倍。另外，50℃是高压CO2钝化香蕉果肉多酚氧化酶的关键转折点，当温度低于50℃时，高压CO2钝化香蕉果肉多酚氧化酶的效率一般，但当温度高于50℃后，高压CO2钝化香蕉果肉多酚氧化酶的效率显著提高。例如，20MPa、55℃的高压CO2处理40min后能钝化83.5%的香蕉果肉多酚氧化酶，当温度升到60℃，20MPa的高压CO2处理时，20min处理后仅残留有4.2%的多酚氧化酶活力。

此外，使用两段模型估算出了不同温度处理下高压CO2(20MPa)处理香蕉果肉多酚氧化酶快速钝化期的D和ZT值。从图4可知，随着温度的升高，D值的常用对数呈线性下降(R2=0.984)，估算出高压CO2(20MPa)处理钝化香蕉果肉多酚氧化酶在快速钝化期的ZT值为14.78℃。ZT值是表征酶对温度钝化敏感性的指标，ZT值越大，说明该酶对温度的耐受性越大。常压处理下，香蕉果肉多酚氧化酶钝化的ZT值为100.7℃，这也仅一步证明高压CO2处理能显著提高香蕉果肉多酚氧化酶的热敏感性。

(20MPa)处理钝化香蕉果肉多酚氧化酶在快速钝化期的ZTFig.4 ZTfor PPO from banana pulp treated by high pressure carbon dioxide at 20 MPa during quick inactivation图4 高压CO2

2.4 样品pH值对高压CO2处理钝化香蕉果肉多酚氧化酶的影响

表3 不同pH值的香蕉果肉经高压CO2(20MPa，50℃)处理后的多酚氧化酶相对残留酶活力Table3 Relative residual activity (%) of PPO sample with different pH from banana pulp exposed to high pressure carbon dioxide (20 MPa, 50℃) %

从表3可知，样品的pH值能显著影响高压CO2处理对香蕉果肉多酚氧化酶的钝化效果。20MPa，50℃的高压CO2处理30min后，pH3.5的样品中仅残留有8.4%的酶活力，而pH7.5的样品中多酚氧化酶的活力几乎没有变化。目前，对于实时动态监控高压CO2处理过程中样品pH值变化设备仍然缺乏，我们仅仅测量了样品在高压CO2处理前和处理后的pH值(释放到正常大气压后立即测定其pH值)。高压CO2处理后样品的pH值都有下降。

研究发现，在常压温热处理中，pH值较低的果汁样品中多酚氧化酶的热敏感性明显高于pH值较高的果汁样品[18-19]。在高压CO2处理中，溶解于样品中CO2与水结合形成碳酸，从而使样品溶液的pH值降低，很多研究认为这可能是导致酶结构改变和失活的原因之一[16-17,20]。结果表明，在高压CO2处理钝化香蕉果肉多酚氧化酶的过程中，低pH值样品中多酚氧化酶的钝化效率明显高于中性pH值样品，这可能用上述机制来解释。

3 结 论

高压CO2处理能有效的钝化香蕉果肉多酚氧化酶，且高压CO2处理对香蕉果肉多酚氧化酶的钝化过程符合两段模型。提高处理温度和延长处理时间能显著提高香蕉果肉多酚氧化酶的钝化速率；在达到CO2超临界点前，高压CO2压力的增加能显著提高酶的钝化速率，而当达到二氧化碳超临界点前后，CO2压力的继续增加将不能明显提高酶的钝化效率。

样品的pH值能显著影响高压CO2处理对香蕉果肉多酚氧化酶的钝化效果。酸性样品中香蕉果肉多酚氧化酶的钝化效率明显高于中性样品中酶的钝化效率。20MPa，50℃的高压CO2处理30min后，pH3.5的样品相对残留酶活力仅有8.4%，而pH7.5的样品中多酚氧化酶的活力几乎没有变化。

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Inactivation Kinetics of Polyphenol Oxidase from Banana Pulp by High-Pressure Carbon Dioxide

WANG Shao-hua1,2，YU Yuan-shan1，XU Yu-juan1,*，XIAO Geng-sheng1，WU Ji-jun1，TANG Dao-bang1，CAO Qing-ming2
(1. Sericulture and Agri-food Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510610, China；2. College of Food Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China)

In this paper, effect of high-pressure carbon dioxide on inactivation of polyphenol oxidase (PPO) from banana pulp was studied, and inactivation kinetics of PPO was analyzed by using a two-fraction model. Results showed that the inactivation of PPO by high-pressure carbon dioxide could be significantly affected by the pressure of carbon dioxide, processing temperature, processing time and sample pH. The inactivation kinetics of PPO was adequately described by using a two-fraction model. High pressure carbon dioxide treatment was an effectively way to inactivate PPO from banana pulp, and the inactivation rate of PPO could be significantly increased by improving carbon dioxide pressure and treatment time, and decreasing sample pH. The reduced residual activity of PPO exposed to high-pressure carbon dioxide (20 MPa, 55 ℃) was 83.5% for 40 min, and only 4.2% of enzyme activity was remained when treated with high-pressure carbon dioxide (20 MPa, 60 ℃) for 20 min.

high-pressure carbon dioxide；banana pulp；polyphenol oxidase；inactivation

TS255

A

1002-6630(2013)03-0217-05

2011-12-11

广东省自然科学基金项目(S2011020001226)；广东省农业科技项目(LNSG2010-14)

汪少华(1986—)，男，硕士研究生，研究方向为食品加工。E-mail：wsh_517@163.com

*通信作者：徐玉娟(1974—)，女，研究员，硕士，研究方向为果蔬加工与保鲜。E-mail：xyj6510@126.com