应用流式细胞术检测EphA2及其调节基因HoxA1、C-m yc在喉癌组织中的表达及相互关系

石栋梁，杜 涛，习国平*

（1.河北省邯郸市第三医院耳鼻咽喉头颈外科，河北邯郸056001；2.河北省邯郸市第二医院内窥镜室，河北邯郸056001）

·论 著·

应用流式细胞术检测EphA2及其调节基因HoxA1、C-m yc在喉癌组织中的表达及相互关系

石栋梁1，杜 涛2，习国平1*

（1.河北省邯郸市第三医院耳鼻咽喉头颈外科，河北邯郸056001；2.河北省邯郸市第二医院内窥镜室，河北邯郸056001）

目的从蛋白水平探讨HoxA1、C-myc、EphA2与喉癌发生发展的关系，从分子生物学角度探讨喉癌的发病机制。方法①喉癌组织40例及癌旁组织40例，取15例非喉癌患者的喉部正常黏膜组织做对照。所有肿瘤组织均经病理学确诊为鳞状细胞癌，癌旁组织及喉部正常黏膜均经病理证实为炎症或正常黏膜。②应用流式细胞术检测喉癌组织、癌旁组织及喉部正常黏膜组织的EphA2和HoxA1、C-myc蛋白表达的含量。结果EphA2蛋白、HoxA1蛋白、C-myc蛋白在喉癌组织中的表达量分别高于癌旁组织和正常喉黏膜组织，而癌旁组织与正常黏膜组织间的表达差异无统计学意义。喉癌组织中EphA2蛋白与HoxA1蛋白、C-myc蛋白有多元线性回归关系，EphA2蛋白与HoxA1蛋白呈正相关，与C-myc蛋白呈负相关，Y=0.983+0.739X1-0.323X2（P=0.000）。结论EphA2蛋白、HoxA1蛋白和C-myc蛋白在喉癌中的表达与喉癌的发生发展有关。

喉肿瘤；受体，EphA2；流式细胞术

喉癌的发生、发展与多种癌调节基因及信号转导通路的改变有关，其中促红细胞生成素产生肝细胞受体（Eph受体）与癌细胞增殖、发展有关；Hox基因作为细胞增殖分化的调节基因，不仅调控胚胎细胞的增殖和分化，而且也是成人组织细胞增殖和分化的重要调节基因。若Hox基因发生异常表达，就会导致个体发育和组织器官形成过程中出现异常的形态结构，并可致细胞恶性转化形成肿瘤。C-myc基因属于核蛋白类调控基因，其在细胞周期变化，细胞的生长代谢，基因的不稳定性，刺激血管生成，细胞恶性转化、分化及凋亡中起重要的调节作用。EphA2的表达受到许多基因的调控，本研究从分子水平探讨HoxA1、C-myc与EphA2在喉癌细胞中的关系。

1 资料与方法

1.1 材料：选择40例喉癌组织及40例相应癌旁组织，同时选择15例非喉癌患者的喉部正常黏膜组织做对照。所有肿瘤组织均经病理学确诊为鳞状细胞癌，癌旁组织及喉部正常黏膜均经病理证实为炎症或正常黏膜。喉癌病例中男性37例，女性3例；年龄40～72岁，中位年龄56岁；有淋巴结转移12例，无淋巴结转移28例（有无淋巴结转移根据术后病理而定）；临床分期采用国际抗癌协会2001年公布的TNM分类分期标准，Ⅰ、Ⅱ期16例，Ⅲ、Ⅳ期24例，其中 T1N0M06例，T2N0M010例，T2N1M02例，T2N2M01例，T3N0M09例，T3N1M02例，T3N2M06例，T4N0M03例，T4N2M01例。所有标本取材后立即用液氮冷藏保存。

1.2 方法：应用美国Beckerman Coulter公司生产的Epics-XLⅡ型流式细胞仪，激发光源为15mW氩 LogX-Mode×340，阳性结果的判定，如果FI＞1.0为阳性表达，FI≤1.0为阴性表达。

1.3 统计学方法：应用SPSS11.5软件进行统计分析。计量资料以±s表示，分别采用单因素方差分析和q检验；EphA2、Hoxa1和C-myc之间的关系采用多元线性回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

EphA2蛋白与HoxA1蛋白、C-myc蛋白在喉癌组织中的表达量均高于正常组织及癌旁组织，而正常组织与癌旁组织间表达差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

EphA2蛋白与HoxA1蛋白、C-myc蛋白有多元线性回归关系，EphA2蛋白与HoxA1蛋白呈正相关（EphA2蛋白表达随着HoxA1蛋白表达的增加而增加），与C-myc蛋白呈负相关（EphA2蛋白表达随着C-myc蛋白表达的减低而增加），多元线性回归方程为Y=0.983+0.739X1-0.323X2（P=0.000）。离子激光器，激发波长为488nm，应用Expo32ADC进行免疫荧光数据分析，用Muticycle AN分析软件对DNA细胞周期拟合分析。检测前以flow-checkTMFlourpheres（10μm）荧光微球（REF 6605359.Beckman Coulter，Inc.Fullerton，CA92835）作为标准样品调整仪器CV值在2%以下。按照Morkve等提出的荧光指数（fouling index，FI）表示Erythropoietinproducing hepatocellular receptor A2（EphA2），Hox genes a1（HoxA1）和cell-myc（C-myc）蛋白表达的相

表1 EphA2、HoxA1和C-myc在癌组织及癌旁、正常组织中的表达Table 1 The quantitative expression of EphA2，HoxA1 and C-myc in laryngeal carcinomas，para-carcinoma tissues and normalmucosa tissues（FI，x¯±s）

3 讨 论

Eph受体是酪氨酸蛋白激酶受体家族中最大的分支，有对细胞增殖的调节作用。EphA2的过度表达具有转化正常细胞的能力，当Eph-ephrin系统正常表达时可抑制细胞增生，异常表达时又可以促进细胞的转化。Fujii等［1］将重组ephrinA1绑定到石川细胞的表面，而致EphA2及A4磷酸化。Hox基因不仅调控胚胎细胞的增殖和分化，而且也是成人组织细胞增殖和分化的重要调节基因。若Hox基因发生异常表达，就会导致个体发育和组织器官形成过程中出现异常的形态结构，并可致细胞恶性转化形成肿瘤。C-myc原癌基因激活的主要方式是该基因的扩增和过表达，证明其在细胞周期变化，细胞的生长代谢，基因的不稳定性，刺激血管生成，细胞恶性转化、分化及凋亡中起重要的调节作用。肿瘤细胞为了生长和转移必须获得血液供应，通常认为通过血管发生来达到上述目的。

细胞迁移是肿瘤侵袭和转移的重要环节，细胞与细胞外基质的黏附与解离是其必要的步骤。多种Eph受体及配体在肿瘤中尤其是肿瘤生长的高侵袭性阶段有正调节作用。EphA2的过度表达不仅能导致正常细胞的恶性转化，而且能增强肿瘤细胞向外侵袭的能力，这是通过削弱肿瘤细胞之间的连接，增加肿瘤细胞与细胞外基质成分的黏附和增强在基质的侵袭等几方面而实现的。

Karidis等［2］研究发现EphA2与甲状腺肿瘤生成有关。EphA2的表达增高与疾病分期及预后都有一定关系，因此，EphA2可以在临床分析中作为一个独立的诊断指标。Fujii等［3］采用印迹分析证实人类子宫内膜 EphA2蛋白的存在。Brantley-Sieders等［4］研究表明EphA2在肿瘤新血管形成及侵袭转移中起到了很重要的作用。Cheng等［5］研究表明，阻断EphA受体酪氨酸激酶可以抑制血管内皮生长因子诱导的血管生成。Fox等［6］对3种乳腺上皮细胞（MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231）的研究结果表明，EphA2在侵袭性乳腺癌细胞中的表达明显高于在其他2种细胞中的表达。Giaginis等［7］发现EphA2在胰腺癌中的表达与患者的年龄显著相关。

HoxA1可控制细胞周期，通过结合蛋白磷酸酶2A和蛋白磷酸酶1的催化亚基发挥作用。这种结合启动G2停止期的非洲蟾蜍卵母细胞以及G2停止期、DNA受损的Jurket细胞进入M期。Kang等［8］研究表明HoxA1在胃癌细胞中较癌旁正常黏膜上皮明显高表达，成为胃癌DNA甲基化标记物之一。Tsou等［9］研究表明HoxA1在肺腺癌细胞中的超甲基化水平远高于正常细胞（P＜0.01）。但HoxA1在喉癌中的表达未见报道。

Krecicki等［10］认为，C-myc基因扩增量与C-myc蛋白表达量无关，C-myc蛋白表达在淋巴结阴性组中高于淋巴结阳性组可能是由于随着肿瘤细胞的进展其 mRNA变得更加不稳定所致。而 Zelinski等［11］的研究显示，C-myc对EphA2的下调在乳腺上皮细胞中有效，而在癌细胞中EphA2对C-myc却不敏感。C-myc和EphA2在喉癌中究竟有无因果关系以及其机制是什么，有待于进一步研究。本研究结果显示EphA2和HoxA1、C-myc在喉癌组织中的表达阳性，其可能参与肿瘤的恶性转化过程，调节肿瘤细胞的增殖和分化。提示将来通过调节这些蛋白的表达可能在喉癌的临床治疗中有一定应用价值。尽管关于喉癌的此类研究较少，但是我们也可以推测EphA2和HoxA1、C-myc蛋白的表达变化与喉癌的发生、生长和转移有关，其在喉癌组织中的阳性表达可能预示癌细胞的侵袭与转移，EphA2和HoxA1、C-myc蛋白的表达可能对判断喉癌的恶性程度、病情进展有重要价值。

总之，喉癌细胞中EphA2和HoxA1、C-myc共同促进了喉癌的发生发展，为喉癌的诊断和治疗提供了一个新的靶点。因此，深入研究EphA2和Hoxa1、C-myc的生物学作用及其作用机制，进而选择最佳靶位，可能为封闭、阻断喉癌的发生发展提供更有力的依据。

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（本文编辑：刘斯静）

THE EXPRESSION AND RELATIONSOF EPHA2，HoxA1 AND C-myc IN LARYNGEAL CARCINOMA W ITH FLOW CYTOMETERE

SHIDongliang1，DU Tao2，XIGuoping1*
（1.Department of Otolaryngology，the Third Hospital of Handan City，Hebei Province，Handan 056001，China；2.Endoscopy Room，the Second Hospital of Handan City，Hebei Province，Handan 056001，China）

Objective To explore the genesismechanism of laryngeal carcinoma at the level of molecular biology.M ethods ①Forty laryngeal carcinoma fresh sampleswere analyzed andmeanwhile 40 para-carcinoma tissues and 15 normal laryngealmucosa samples were also studied as controls.All tumor tissueswere confirmed to be squamous-cell carcinoma；the para-carcinoma tissues and normalmucosa were confirmed to be inflammatory or normalmucosa pathologically.②The expression of erythropoietinproducing hepatocellular receptor A2（EphA2），Hox genes A1（HoxA1）and cell-myc（C-myc）protein weremeasured with flow cytometere.Fluorescence index was defined as the quantitative expression index of EphA2，HoxA1 and C-myc protein.Results The quantitative and qualitative expressions of EphA2 protein，HoxA1 protein，C-myc protein in laryngeal carcinoma tissues were obviously higher than those in para-carcinoma and in normal laryngealmucosa tissues respectively；There was no significant difference between the expression of para-carcinoma and normal laryngealmucosa tissues.There wasmultiple linear regression relationship in the expression of EphA2，HoxA1 and C-myc in laryngeal carcinoma.The expression of EphA2 protein was positively correlated with HoxA1 protein，while negatively correlated with C-myc protein.The multiple linear regression equation was Y=0.983+0.739X1-0.323X2（P= 0.000）。Conclusion The expression of EphA2，HoxA1 and C-myc contribute to the carcinogenesis and

laryngeal neoplasms；receptor EphA2；flow cytometry

R735.7

A

1007-3205（2013）03-0294-04

2012-02-25；

2012-05-19

石栋梁（1971-），男，河北魏县人，河北省邯郸市第三医院主治医师，医学硕士，从事头颈肿瘤外科疾病诊治研究。

*通讯作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.03.016

development of laryngeal carcinoma.