叶黄素对体外培养的人食管癌Ec-9706细胞增殖和凋亡的影响

2013-03-03任广伟高福禄

河北医科大学学报 2013年3期

关键词：光密度叶黄素河北

李莉，任广伟，赵昱，龚淼，孟丽，高福禄

（1.河北医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，河北石家庄050017；2.河北医科大学第一医院肾内科，河北石家庄050031；3.河北师范大学生命科学院，河北石家庄050024）

·论著·

叶黄素对体外培养的人食管癌Ec-9706细胞增殖和凋亡的影响

李莉1，任广伟2，赵昱1，龚淼1，孟丽1，高福禄3*

目的探讨叶黄素对体外培养的人食管癌9706细胞（esophageal carcinoma 9706，Ec-9706）增殖和细胞凋亡的影响。方法将Ec-9706细胞用含10%胎牛血清的RPMIl640培养基于37℃、5%CO2/95%空气饱和湿度培养箱中培养。采用随机数字表法，将其随机分为4组：对照组（C组）和不同浓度叶黄素组（L1～3组）。L1～3组分别加入40、80和160μmol/L叶黄素；C组加入等体积RPMI1640培养液。采用噻唑兰法检测不同浓度叶黄素对人食管癌Ec-9706细胞增殖的影响；采用流式细胞术检测Ec-9706细胞凋亡情况；采用免疫细胞化学方法检测Fas、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、cyclin D1和Caspase-3蛋白的表达。结果叶黄素可抑制Ec-9706细胞的增殖，诱导Ec-9706细胞的凋亡，且呈剂量依赖性。叶黄素可下调Ec-9706细胞PCNA和cyclin D1蛋白表达，上调Fas和Caspase-3蛋白表达，且呈剂量依赖性。结论叶黄素可抑制体外培养的人食管癌Ec-9706细胞的增殖，诱导其凋亡，且呈浓度依赖性，其机制与下调PCNA和cyclin D1蛋白表达，上调Fas和Caspase-3蛋白表达有关。

食管肿瘤；细胞增殖；细胞凋亡；叶黄素

叶黄素是广泛存在于自然界植物中的一种含氧类胡萝卜素。流行病学和动物实验研究表明，叶黄素在视觉保护、增强免疫功能、预防慢性病和降低癌症发生等方面有广泛的生物学活性［1］。有研究［2］表明，叶黄素在抗消化道肿瘤方面有显著作用，尤其是食管癌。但其机制尚未见报道。本研究拟探讨叶黄素对体外培养的人食管癌9706细胞（esophageal carcinoma 9706，Ec-9706）增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和仪器：RPMI1640培养基（Gibco公司，美国），胎牛血清（杭州四季青生物制品公司），噻唑兰和碘化丙啶荧光染料（Sigma公司，美国），兔抗人 Fas抗体、兔抗人增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗体、兔抗人cyclin D1抗体和兔抗人Caspase-3抗体、SP试剂盒和二氨基联苯胺试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），叶黄素（Sigma公司，美国），胰蛋白酶（Sigma公司，美国）；HF-212UV CO2恒温培养箱（上海一恒科技有限公司），Motic AE31倒置显微镜（Motic公司，德国），DG5031型酶联免疫检测仪（上海华东电子集团医疗装备公司），Epics-XLⅡ型流式细胞仪（Beckman Coulter公司，美国）。

1.1.2 细胞株：Ec-9706细胞株由中国医学科学院肿瘤研究所建系，本实验室冻存。将Ec-9706细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基于37℃、5%CO2/95%空气饱和湿度培养箱中培养，每天用0.25%胰酶消化，以1∶2传代1次。

1.2 方法

1.2.1 叶黄素溶液的配制：实验前将叶黄素用1mL二甲基亚砜充分溶解，用 RPMI1640培养液配成终浓度为320μmol/L的母液，4℃冰箱避光保存备用。

1.2.2 实验分组：采用随机数字表法，将其随机分为4组，即对照组（C组）和不同浓度叶黄素组（L1～3组）。L1～3组分别加入40、80和160μmol/L叶黄素；C组加入等体积RPMI1640培养液。

1.2.3 叶黄素对Ec-9706细胞增殖影响的测定：取对数生长期的Ec-9706细胞和正常人外周血单个核细胞，接种于96孔培养板中，每孔滴加200μL单细胞悬液，使每孔含1.7×103个细胞，设8个复孔，同时接种6个96孔板，常规培养24 h。分别在孵育24、48和72h，取出2块培养板，每孔滴加噻唑兰溶液（5g/L）20μL，37℃培养箱孵育4 h后终止培养。弃上清，每孔滴加二甲基亚砜200μL，振荡15 min。酶标仪在570 nm处测定各孔吸光度，计算细胞增殖抑制率 =（1-实验组吸光度值/对照组吸光度值）×100%。

1.2.4 叶黄素对Ec-9706细胞凋亡影响的测定：取12瓶对数生长期 Ec-9706细胞，分别于24、48和72h取出不同药物浓度细胞4瓶，收集细胞分别放入4个15mL离心管内标记后进行离心，制成浓度为7×108个/L的单细胞悬液离心后弃上清液缓慢加入预冷70%无水乙醇7mL，4℃过夜。采用碘化丙啶单染法，每份样品中加入鸡红细胞作为内参标准，与样品同步染色，每份样品中加入1mL碘化丙啶染液，在4℃避光孵育30min。用488nm氩离子激光器激发由630nm带通滤光片接收，通过散点图收集10 000个细胞，分析碘化丙啶荧光直方图上凋亡细胞百分率。

1.2.5 Fas、PCNA、cyclin D1和Caspase-3蛋白表达的测定：取对数生长期细胞制成浓度为1×107个/L的单细胞悬液，接种到放有盖玻片的6孔板，培养箱孵育24h，使细胞贴壁于盖玻片上。分别于孵育24、48和72h后取出盖玻片，SP法进行免疫细胞化学染色，3%甲醇-H2O2室温处理10min，微波抗原修复（9℃）15min。免疫细胞化学染色。用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。采用图像分析系统进行定量分析，每张玻片随机取5个高倍视野，测定特异性着色的积分光密度值，反映目的蛋白的表达水平。

1.3 统计学方法：应用SPSS13.0统计学软件进行数据分析，计量资料以±s表示，分别采用单因素方差分析和q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 叶黄素对Ec-9706细胞增殖的影响：与C组比较，L1～3组细胞增殖抑制率升高，且呈浓度依赖性，见表1。

表1 4组Ec-9706细胞增殖抑制率比较Table 1 Comparison of inhibitory rate of Ec-9706 cells proliferation in 4 groups（n=7，±s，%）