CD40信号对宫颈癌血管生成的影响

·论 著·

CD40信号对宫颈癌血管生成的影响

CD40是相对分子质量为4 800的Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNF-R）超家族成员，不仅表达于B细胞、T细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等，在机体免疫应答中占极重要的作用。研究［1］发现CD40还表达于一些肿瘤细胞，如霍奇金淋巴瘤、急慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、膀胱癌、卵巢癌、鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等，具有促进肿瘤血管生成的作用，在肿瘤的发生、发展、浸润、转移中发挥重要的作用。干预CD40信号有望成为肿瘤治疗的新方向。本文通过研究CD40在宫颈鳞癌细胞株（human cervical squamous epithelium cancer cell line，SiHa）上的表达情况，以及CD40信号对宫颈癌血管生成的影响，旨在为宫颈癌的治疗寻找新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料：SiHa购自上海中科院细胞研究所。人脐静脉内皮细胞株（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）受赠于苏州大学医学生物技术研究所。激发型鼠抗人CD40单克隆抗体（5C11）由苏州大学医学院生物技术研究所研制［2］。PE-二抗购自法国Immunotech公司。白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）检测试剂盒购自上海晶美生物工程公司。EPICS-ALTRA型流式细胞仪为美国Beckman Coulter公司产品；酶标仪为美国BIORAD公司产品。

1.2 方法

1.2.1 流式细胞仪分析CD40在SiHa及HUVEC

细胞上的表达：收集对数生长期SiHa及HUVEC细胞，制备单细胞悬液，与 1μg 5C11在 4℃作用30min，PBS洗涤2次，离心后弃上清，再与50μL工作浓度PE-二抗在4℃作用30min，洗涤2次，加入固定液，上流式细胞仪检测分析。同时用同种亚型的鼠IgG作为阴性对照。

1.2.2 ELISA法检测5C11对SiHa及HUVEC细胞分泌VEGF及IL-6的影响：收集对数生长期SiHa及HUVEC细胞，接种于24孔培养板中，每组3个复孔，每孔体积1mL。a组，每孔接种105个SiHa细胞。b组，每孔接种105个SiHa细胞，并加入5C11，使其终浓度为 2mg/L。c组，每孔接种 105个HUVEC细胞。d组，每孔接种105个HUVEC细胞，并加入5C11，使其终浓度为2mg/L。置于37℃，5% CO2培养箱中培养 24h，收集细胞上清，在2 000r/min下离心 5min后，ELISA检测上清中VEGF及IL-6的分泌情况。

1.2.3 MTT法检测5C11对HUVEC细胞增殖的影响：收集对数生长期SiHa及HUVEC细胞，分6组接种于96孔培养板中，每组3个复孔，每孔体积200μL。A组，每孔接种104个HUVEC细胞。B组：每孔接种104个HUVEC细胞，并加入5C11，使其终浓度为2mg/L。C组，每孔接种103个SiHa细胞。D组，每孔接种103个SiHa细胞，并加入5C11，使其终浓度为2mg/L。E组，每孔接种104个HUVEC细胞和103个SiHa细胞，使其浓度比为10∶1。F组，每孔接种103个SiHa细胞，并用2mg/L 5C11预处理8～12h，再与104个HUVEC细胞共培养。置于37℃，5%CO2培养箱中培养48h，噻唑蓝［3-（4，5）-dimethylthna 20（-z-yl）-2，5-diphernyltetra zolium bromide，MTT］法测吸光度（obsorbance，OD）值。

1.3 统计学方法：应用SPSS13.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CD40在SiHa及HUVEC细胞上的表达：SiHa及HUVEC细胞表面均高表达CD40（图1），表达率分别为91.3%、91.1%。

图1 SiHa及HUVEC细胞表面CD40的表达A.IgG（CD40 1.1%）；B.SiHa（CD40 91.3%）；C.HUVEC（CD40 91.1%）Figure 1 The expression of CD40 in SiHa and HUVECA.IgG（CD40 1.1%）；B.SiHa（CD40 91.3%）；C.HUVEC（CD40 91.1%）

2.2 5C11对 SiHa分泌 VEGF及 IL-6的影响：SiHa细胞能够自分泌VEGF及IL-6，经5C11刺激后分泌量增加。5C11刺激前后 SiHa细胞分泌VEGF的浓度分别为（1 436.73±193.40）、（1 983.17±119.12）ng/L，差异有统计学意义（P＜0.05）。5C11刺激前后SiHa细胞分泌IL-6的浓度分别为（902.13±132.61）、（1 397.50±122.45）ng/L，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 5C11对HUVEC分泌VEGF及IL-6的影响：HUVEC能够自分泌VEGF及IL-6，经5C11刺激后分泌量无明显变化。5C11刺激前后HUVEC分泌VEGF的浓度分别为（2 084.80±217.88）、（2 131.13±144.71）ng/L，差异无统计学意义（P＞0.05）。5C11刺激前后HUVEC分泌IL-6的浓度分别为（1 461.40±74.70）、（1 466.73±58.49）ng/L，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 5C11及SiHa细胞对HUVEC细胞增殖的影响：5C11对HUVEC的生长无明显影响，HUVEC单独培养48h的OD值为1.262±0.116，与5C11共同培养48h OD值为1.221±0.063，差异无统计学意义（P＞0.05）。

SiHa细胞对 HUVEC的生长有促进作用，HUVEC单独培养48h的OD值为1.262±0.116，与1/10数量的SiHa共同培养48小时OD值明显升高，为 2.081±0.059，差异有统计学意义（P＜0.05）。

5C11激发SiHa细胞后对HUVEC的生长促进作用更明显。1/10数量的SiHa与5C11共培养48h OD值为0.187±0.025，SiHa细胞无明显增殖或生长抑制（P＞0.05）。SiHa细胞经5C11刺激后再与HUVEC共同培养48h OD值为2.425±0.103，较HUVEC单独培养时OD值明显增高（P＜0.05），同时较HUVEC与SiHa细胞共培养时OD值也明显升高（P＜0.05）。

3 讨 论

子宫颈癌是全球第2位高发妇科恶性肿瘤。研究［3］显示，我国子宫颈癌有发病率进一步增高，且发病年龄趋于年轻化趋势。目前临床应用的手术、放疗、化疗以及介入等治疗，在杀死癌细胞的同时损伤人体正常细胞，且无法从根本上将癌症根治，尤其是中晚期癌症。故对宫颈癌的发生、发展、浸润、转移机制以及诊治的研究具有重要意义。

研究［4-7］发现 CD40还表达于一些肿瘤细胞上，如霍奇金淋巴瘤、急慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、膀胱癌、卵巢癌、鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌等。其介导的信号在肿瘤的发生、发展、浸润、转移中发挥着重要的作用。

血管生成与肿瘤的发生发展密切相关，1971年哈佛大学Folkman教授［8］提出实体肿瘤的生长和转移依赖于新生血管生成的观点。HUVEC提取于人脐带静脉组织，是研究血管内皮细胞常用的细胞类型。VEGF又称血管通透因子，是目前研究较为深入的促血管生成因子。它是一种对血管生成有极强诱导作用的因子，能特异性作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞分裂、增殖、细胞质钙聚集以及诱导血管生成等［9-10］。许多人体肿瘤均有VEGF的过度表达，在宫颈癌中VEGF的合成和分泌主要在肿瘤细胞和内皮细胞，并主要以自分泌和旁分泌途径作用于肿瘤细胞和内皮细胞。本研究发现宫颈鳞癌SiHa细胞及HUVEC自身能够分泌VEGF，从而促进血管生成，促进肿瘤浸润及转移。

IL-6是一种多功能的细胞因子，可由多种细胞产生，在B淋巴细胞、T淋巴细胞、造血干细胞的增

殖分化、中枢神经系统、炎症反应、自身免疫性疾病和某些肿瘤中起重要的作用。它在多种肿瘤中有异常表达，与肿瘤中的血管生成有关，并可增加肿瘤细胞活动性，减少细胞间的粘连结合，促进肿瘤浸润及转移［11］。Wei等［12］用重组人 IL-6加入宫颈癌C33A细胞中，可诱导该细胞株产生时间和剂量依赖性的VEGF，同样，使用IL-6抗体或IL-6受体抗体能使另一种宫颈癌细胞SiHa细胞减少VEGF的表达。在体内IL-6通过正向调节VEGF，可增强人宫颈癌细胞的血管形成，同时在裸鼠体内使用抗VEGF抗体阻断VEGF的功能，可抑制IL-6介导的血管形成及肿瘤生长。本研究发现SiHa及HUVEC不仅能分泌VEGF，也能分泌IL-6，从而促进血管生成，促进肿瘤浸润及转移。

CD40-CD40L作为机体免疫系统中一对重要的共刺激分子，不仅在B细胞和树突状细胞的活化有重要作用，在肿瘤的生长、分化、转移中也有一定的作用。研究［13］表明CD40的激活可以促使血管内皮细胞生长，从而促使肿瘤血管生成。CD40信号活化后，能通过MAPK、PI3K/Akt等信号转导途径上调VEGF、IL-6、PAF等因子，进而通过抑制内皮细胞凋亡、促使血管内皮细胞生长等途径促使肿瘤血管生成［14-15］。Xie等［16］在人神经胶质瘤细胞中发现CD40信号活化可诱导VEGF表达和分泌，从而参与新生血管形成。本研究表明CD40信号能够上调宫颈癌细胞分泌VEGF及IL-6，进而促进肿瘤血管生成，促进宫颈癌生长、浸润及转移。

本研究发现HUVEC细胞单独培养能分泌VEGF及IL-6，而经5C11刺激后分泌量改变不明显。5C11作用后HUVEC细胞未出现明显生长抑制或促进。表明CD40信号不直接影响HUVEC分泌VEGF、IL-6等促血管生成因子，也不直接影响其生长增值。但是，本研究发现宫颈鳞癌SiHa细胞能够促进HUVEC细胞生长，经5C11刺激后的SiHa细胞对HUVEC细胞的生长促进作用更明显。

综上所述，CD40信号可能通过促进宫颈癌细胞分泌VEGF及IL-6来促使血管内皮细胞生长，从而促使肿瘤血管生成，肿瘤发生浸润转移。干预CD40信号有望成为宫颈癌治疗的新方向。

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（本文编辑：刘斯静）

倪冬梅1，黄 沁2*，瞿秋霞3，沈宗姬2
（1.浙江省湖州市妇幼保健院妇产科，浙江湖州313000；2.苏州大学附属第一医院妇产科，江苏苏州215006，3.苏州大学医学生物技术研究所，江苏苏州215006）

目的探讨CD40信号对宫颈癌血管生成的影响。方法采用流式细胞术检测CD40在宫颈鳞癌细胞株（human cervical squamous epithelium cancer cell line，SiHa）及人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）上的表达；酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测CD40信号对SiHa及HUVEC分泌血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）的影响；噻唑蓝法检测CD40信号对HUVEC增殖的影响。结果SiHa及HUVEC细胞表面均高表达CD40。SiHa细胞能够分泌VEGF及IL-6，经激发型CD40单克隆抗体（5C11）刺激后分泌量均增加。HUVEC细胞能够分泌VEGF及IL-6，经5C11刺激后分泌量均无明显变化。5C11对HUVEC的增殖无明显影响，SiHa细胞对HUVEC的生长增殖有促进作用，经5C11激发后促增殖作用更明显。结论宫颈鳞癌细胞能够自分泌VEGF及IL-6，促进血管内皮细胞生长，CD40信号可能通过促进宫颈癌细胞分泌VEGF及IL-6来促进血管内皮细胞生长，从而介导新生血管生成，肿瘤发生浸润转移。

宫颈肿瘤；CD40配体；内皮，血管

THE EFFECT OF CD40 SIGNAL ON THE ANGIOGENESISOF CERVICAL CANCER

NIDongmei1，HUANG Qin2*，QU Qiuxia3，SHEN Zongji2
（1.Department of Gynaecology and Obstetrics，Maternal and Child Health Hospital，Huzhou City，Zhejiang Province，Huzhou 313000，China；2.Department of Gynaecology and Obstetrics，the First Affiliated Hospital of Soochow University，Suzhou City，Jiangsu Province，Suzhou 215006，China；3.Medical Biotechnology Institute，Soochow University，Suzhou City，Jiangsu Province，Suzhou 215006，China）

Objective To study the effect of CD40 signal on the angiogenesis of cervical cancer.M ethods The expression of CD40 in human cervical squamous epithelium cancer cell line（SiHa）and human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）were determined by flow cytometry（FCM）.Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）was used to detect the secretion for vascular endothelial growth factor（VEGF）and interleukin-6（IL-6）of SiHa and HUVEC.And agonistic antihuman CD40 monoclonal antibody（5C11）was used to active CD40 signal.The proliferation of HUVEC was analyzed by 3-（4，5）-dimethylthna 20（-z-yl）-2，5-diphernyltetra zolium bromide（MTT）reduction assay after treating with 5C11 and SiHa.Results SiHa and HUVEC cell lines both highly expressed CD40，their expression rateswere 91.3%and 91.1%respectively.SiHa can autocrine VEGF and IL-6，and 5C11 can significantly increase their secretion.HUVEC can autocrine VEGF and IL-6，but，5C11 had no effect on their secretion.5C11 had no effect on the proliferation of HUVEC，while SiHa can significantly promote the proliferation of HUVEC and 5C11 combined with SiHa can much more significantly promote the proliferation of HUVEC.Conclusion Human cervical cancer cell can autocrine

uterine cervical neoplasms；CD40 ligand；endothelium，vascular

R737.33

A

1007-3205（2013）03-0287-04

2012-06-04；

2012-08-04

倪冬梅（1983-），女，四川江油人，浙江省湖州市妇幼保健院医师，医学硕士，从事妇科肿瘤诊治研究。

*通讯作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.03.014

VEGF and IL-6，and CD40 signal can increase their secretion.CD40 signalmay promote the proliferation of vascular endothelial cell by increasing the secretion of VEGF and IL-6 in cervical cancer.The CD40 signalmay play an important role in the angiogenesis of cervical cancer.