掌叶半夏的HPLC指纹图谱研究

姜 欢 栾 阳 张 慧

辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600

掌叶半夏的HPLC指纹图谱研究

姜 欢 栾 阳 张 慧

辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600

目的：采用高效液相色谱法建立掌叶半夏的HPLC色谱指纹图谱分析方法，为其品质控制提供可靠依据。方法：采用HPLC－UV分析掌叶半夏的指纹图谱。色谱柱：Kromasil ODS－C18（4.6mm×200mm，5μm）流动相：水（A）－甲醇（B），线性梯度洗脱。体积流量：1.0ml/min。柱温：25℃；进样量：10μL。检测波长260nm。测定7批掌叶半夏指纹图谱，应用相似度分析、系统聚类分析，对掌叶半夏进行分类研究。结果：在色谱指纹图谱中，确定了13个共有峰，根据相似度分析、系统聚类分析的结果，将7批药材分为2类。结论：该方法方便，重现性好，可用于掌叶半夏的质量控制。

掌叶半夏；指纹图谱；聚类分析

掌叶半夏为天南星科半夏属植物掌叶半夏Pinellia pedatisecta Schott的干燥块茎，有燥湿化痰、祛风止痉、消肿散结之功效。其主要化学成分有生物碱［1］、甙类、二肽类、氨基酸等［2］。临床上应用于宫颈癌治疗［3］。药材混淆品众多，质量控制指标尚无明确规定。为此，本实验采用HPLC对不同产地的7批药材进行了指纹图谱的研究，建立掌叶半夏较为科学全面的质量评价体系。

1 实验材料与仪器

1.1 药材 7批不同产地药材由安国杏林药材公司和河北光明药材有限公司提供，由辽宁中医药大学中药鉴定教研室鉴定为掌叶半夏的块茎。见表1。

表1 样品编号及来源

1.2 仪器与试药 Agilent HPLC1100液相色谱仪，AT－330恒温柱箱、蒸馏水、甲醇、腺苷对照品。

1.3 色谱条件与适用性试验 色谱柱：Kromasil ODS－C18（4.6mm×200mm，5μm）

流动相：A：水，B：甲醇。线性梯度5min，A－B（90：10）；3min，A－B（90：10）；20min，A－B（86：14）；30min，A－B（10：90）；35min，A－B（0：100）；55min，A－B（0：100）。

流速：1.0m l/min。检测波长260nm。

柱温：25℃；进样量：10μL。

记录时间：75min。

理论塔板数不低于2500。

2 实验方法

2.1 供试品溶液的制备 取掌叶半夏药材粉3g（过3号筛），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30%甲醇25m l，精密称定重量，超声提取30min，放冷，称重，加30%甲醇补足减失的重量，0.45μm微孔滤膜滤过，即得。2.2 对照品溶液的制备 精密称取腺苷对照品7.91mg，置200ml量瓶中，加30%甲醇适量使其溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 测定方法 分别取对照品及供试品溶液经微孔滤膜后，分别精密吸取10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

3 实验结果

3.1 检测波长的确定 取样品溶液，分别在215、254、260、300nm处检测。结果表明，215nm处基线飘移，300nm各色谱峰之间分离度不好，且峰数不足10个，254、 260nm峰数基本相近，但254nm基线不稳定，不能准确积分，为此确定选用260nm为检测波长。

3.2 参照物的确定 测定了7个不同产地掌叶半夏药材样品，药材的色谱峰均在60min之内出现，由于对照品腺苷为已知成分，且其为活性成分，其色谱峰在34min左右，不同产地7个样品均存在，因此选择此峰为参照物峰。

3.3 共有指纹峰的标定 同时测定了未加掌叶半夏平行制备的阴性样品溶液，对阴性液与供试品色谱图进行了比较，排除了阴性干扰峰，以34min出现峰（腺苷）为参照物，选择7个产地药材中保留时间与参照物相对比的相对保留时间一致的峰为共有指纹峰，最终确定共有指纹峰13个，经计算，7个产地的各共有峰相对保留时间RSD＜3%，每个产地色谱图中的共有峰的峰面积之和大于90%。见表2。

表2 掌叶半夏药材指纹图谱共有峰的峰号

3.4 方法学考察

3.4.1 精密度试验 由三个不同实验人员，精密吸取同一供试品溶液10μL，在色谱条件下，重复进样6次，计算共有指纹峰与参照物的相对保留时间及相对峰面积，结果RSD均小于3.0%，表明精密度良好。

3.4.2 稳定性考察 精密吸取供试品溶液10μL，分别在0、2、4、6、8、10h不同时间点进行测定，以上述各共有指纹峰为检测指标，计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积，结果表明，RSD均小于3.0%，供试品溶液在室温10h内稳定性良好。

3.4.3 重复性考察 精密称取山东菏泽掌叶半夏药材6份，按供试品溶液制备样品，分别量取10μL注入液相色谱仪，以上述各共有指纹峰为检测指标，计算共有峰的相对保留时间及峰面积，结果显示，RSD均小于3.0%，重复性良好。

3.4.4 不同产地掌叶半夏化学成分的指纹图谱测定 取7个不同产地掌叶半夏药材粉末，按述供试品溶液制备方法制备样品，分别量取10μL注入色谱仪，进行测定，计算相对保留时间和相对峰面积，结果显示：7个产地的13个共有峰的相对保留时间RSD＜3%，7个产地的共有峰的相对峰面积相差较大，证明不同产地掌叶半夏药材质量有一定差异。见表3、4、图1。

表3 不同产地药材相对保留时间的指纹图谱测定结果

表4 不同产地药材相对峰面积的指纹图谱测定结果

3.4.5 掌叶半夏化学成分指纹图谱的聚类分析研究 本文采用SPSS软件对指纹谱图进行了系统聚类分析，得到聚类树图5－11。聚类树图显示：产地A1、A5、A7聚为1类，A4、A3、A6聚为1类，A2聚为1类。见图2。

4.1 掌叶半夏化学成分指纹图谱方法的建立 本实验以腺苷为参照物，采用梯度洗脱的HPLC法，建立了掌叶半夏药材的指纹图谱的测定方法，确定了13个共有峰，经精密度、稳定性、重复性等方法学考察，RSD%均小于3.0%，证明此方法可行。

4.2 掌叶半夏化学成分指纹图谱的聚类分析 7个产地掌叶半夏指纹图谱的聚类树图显示，产地A1、A5、A7聚为1类，产地A4、A3、A6聚为1类，产地A2与其它6个产地距离较远，聚为1类，聚类分析结果与药材的形态学鉴别基本一致，产地相邻的药材基本聚为一类。

4.3 小结 本实验以腺苷为参照物，采用梯度洗脱的HPLC法，建立了掌叶半夏化学成分指纹图谱。根据7个不同产地掌叶半夏指纹图谱的相对保留时间，确定了13个共有指纹峰和共有峰位置，并建立标准指纹图谱的共有模式。采用系统聚类分析方法，建立了掌叶半夏质量评价体系，对7个产地药材进行了定量分类，聚类分析结果与药材的形态学鉴别基本一致。

实验证明，该方法稳定易行，为评价和控制掌叶半夏药材内在质量提供了科学依据。

［1］秦文娟，王瑞，温月笙，等.掌叶半夏化学成分的研究（Ⅴ）［J］.中草药，1995，26（1）：3.

［2］王瑞，温月笙，杨岚，等.掌叶半夏化学成分的研究［J］.中国中药杂志，1997，22（7）：421－423.

［3］上海第一医学院妇产科医院，基础部化学教研组.掌叶半夏治疗子宫颈癌的研究［J］.上海医学，1978，1（1）：13－16.

R284.1

A

1007－8517（2013）03－0034－02

2012.12.29）