橘红色花菜薹突变体的发现和研究

（北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京 100097）

菜薹〔Brassica campestrisL.ssp.chinensis（L.）Makino var.utilisTsen et Lee〕别名菜心、绿菜薹、菜尖，起源于我国南部，在广东、广西栽培历史悠久，是易抽薹白菜经长期选择和栽培驯化的产物，并演化为不同的类型和品种。菜薹质地柔软，风味可口，营养丰富，不仅在南方地区普遍种植，近年来北方地区也有栽培。

突变体在植物品种改良上具有重要的应用价值。一方面，通过基因突变产生的突变体，可以创造出新的种质资源，增加物种的遗传多样性；另一方面，突变体作为标记性状，可以辅助辨别亲本和一代杂种，显著提高商品种子的纯度和质量。同时，突变体在基因定位、克隆和基因表达、调控等分子生物学研究领域也具有重要意义。

菜薹的花色以黄色为主，但也存在其他花色。2011年5月，笔者在1份菜薹育种材料F3群体中发现了1株突变体，其花色为橘红色。众所周知，橘红心大白菜的花色为橘红色，是一种特殊的大白菜类型，其资源来源于日本。研究发现，大白菜橘红心球色为质量性状，控制橘红心球色的基因为隐性单基因or（张德双 等，2003）。橘红心大白菜具有较高的营养价值，VC含量306.0 mg·kg-1，β-胡萝卜素含量2.6 mg·kg-1（FW），居所有类型大白菜品种之首，尤其是β-胡萝卜素含量，更是普通大白菜品种的6倍以上（张德双 等，2004）。

刘秀村等（2003）应用大白菜DH 群体，获得了1个与橘红心大白菜球色基因紧密连锁的RAPD 分子标记OPB01845，遗传距离为3.8 cM，并将其转化为SCAR 标记SCB01-845。随后，又发现了1个与橘红心球色基因连锁的SCAR 标记（王国臣 等，2007；Zhang et al.，2008），并最终将or基因定位在大白菜1号染色体的长臂末端（于拴仓 等，2007）。Feng 等（2010）获得了与橘红心基因连锁的3个SSR 标记，其中sau（C）586、syau19 在or基因同侧，遗传距离分别为1.6 cM 和1.3 cM；syau15位于另一侧，遗传距离为3.3 cM。

本试验的目的是研究菜薹橘红色花的遗传规律，并应用与大白菜橘红心球色基因连锁的SSR分子标记对控制菜薹橘红色花的基因进行分析，鉴定菜薹的橘红色花基因与大白菜的橘红心球色基因or是否相同，为今后选育橘红色花菜薹一代杂种和获得新的橘红心大白菜种质资源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

橘红色花菜薹11A-47 是笔者于2011年5月发现的1株突变体，其叶色为翠绿色，叶形为近椭圆 形，茎翠绿色，分枝较旺，花色为橘红色，鲜艳且较深（图1）。黄色花菜薹品种为联记特选34号甜菜心，该材料已自交7代，遗传性状稳定、纯合，叶色深绿，叶形为圆形，茎绿色，分枝较旺，花色为黄色。供试材料均来源于北京市农林科学院蔬菜研究中心白菜课题组。

图1 橘红色花菜薹突变体11A-47

1.2 方法

1.2.1 子叶颜色调查方法 2011年5月，在本中心对橘红色花菜薹11A-47 进行自交留种；同时以11A-47 为父本，与黄色花菜薹进行杂交，获得F1种子。2012年6月初，F1自交获得F2，再以F1为母本分别与黄色花菜薹、11A-47 杂交，分别获得BC1和BC1′。参考耿新翠等（2012）的方法并加以改进，调查子叶颜色：7月初，将P1、P2、F1、F2、BC1和BC1′6个世代的种子放置在4℃冰箱中，低温遮光处理15 d后取出，用肉眼观测子叶颜色，记录并对数据进行方差分析。然后，将6个世代种子分别播种到50 孔穴盘中，直到开花，调查并记录各单株花瓣颜色。

1.2.2 根部和髓部颜色调查方法 2012年7月初，待11A-47 和黄色花菜薹的自交种子收获结束后，拔取11A-47 与黄色花菜薹各20株，将菜薹根部洗净，比较11A-47 与黄色花菜薹的根部颜色。再将根部横切即获得髓部，比较二者髓部颜色。

1.2.3 花蕾和花瓣颜色调查方法 在菜薹盛花期，比较11A-47 与黄色花菜薹的花蕾及花瓣颜色。

1.2.4 分子标记方法 以来源于大白菜R9 连锁群（即大白菜1号染色体）、并与橘红心球色基因or连锁的11对SSR 引物对黄色花大白菜、橘红色花大白菜、黄色花菜薹和11A-47 进行标记分析。引物分别为Feng 等（2010）的5 对SSR 引物sau（N）033、sau（C）586、syau15、syau19、ENA21，本中心耐寒类蔬菜育种研究室设计的5 对SSR 引物ba14066、PD7413、PD1355、PD6142、PD7418 和Wang 等（2011）的1对SSR 引物BRID90153。

反应体系（12.5 μL）：1μL 50 ng 模板 DNA，0.6 μL dNTP（2.5 mmol·mL-1），1.25 μL 10×buffer（含Mg2+），上下游引物各0.8 µL（0.5 µmol·mL-1），0.15 µLTaq酶，7.9 µL ddH2O。PCR 反应程序：95℃ 3 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 45 s，共35个循环；72℃延伸10 min。扩增产物用3%超高分辨率琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 橘红色花菜薹突变体11A-47 的植物学性状

2.1.1 橘红色花菜薹子叶颜色的遗传规律 橘红色花菜薹突变体11A-47 6个世代各单株子叶颜色和卡方检测结果见表1和图2。亲本P1为普通黄色花菜薹，子叶颜色全部为绿色；亲本P2为橘红色花菜薹，子叶颜色全部为桔红色，二者杂交F1的子叶颜色均为绿色，说明橘红色花对黄色花为隐性；F2世代子叶颜色出现了分离，橘红色与绿色单株的分离比例符合1∶3，χ2=1.938 9 ＜χ20.05=3.841；BC1世 代中橘红色单株数量很少，约占4.36%；BC1′世代中橘红色与绿色单株的分离比例符合1∶1，χ2=1.369 7 ＜χ20.05=3.841。

2.1.2 橘红色花菜薹根部和髓部颜色 11A-47 与黄色花菜薹根部、髓部颜色见图3和图4。11A-47 的根部、髓部颜色均表现为橘红色，而黄色花菜薹的根部、髓部颜色均表现为白色。据报道，绝大多数类胡萝卜素呈黄色、橘红色或红色，是许多花、果实和胡萝卜根呈现各种颜色的原因（Bartley & Scolnik，1995）。橘红心大白菜叶球之所以呈现橘红色，就是由于高含量β-胡萝卜素等类胡萝卜素的积累所致（Bartley & Scolnik，1995；张华敏 等，2009）。本试验中，橘红色花菜薹11A-47 的根部、髓部颜色均为橘红色，充分表明这些器官积累了类胡萝卜素。

2.1.3 橘红色花菜薹花蕾和花瓣颜色 11A-47 与黄色花菜薹花蕾、花瓣颜色见图5 和图6。11A-47 的花蕾颜色为浅绿色，花瓣为桔红色，花色鲜艳且较深。而黄色花菜薹花蕾颜色为绿色，花瓣为黄色。

表1 黄色花菜薹×11A-47 各世代子叶颜色和卡方检测结果

2.2 SSR分子标记扩增结果

11对SSR 引物对黄色花大白菜、橘红色花大白菜、黄色花菜薹和11A-47 的扩增结果见图7 和表2。其中，BRID90153、PD1355、sau（N）033、sau（C）586、syau15、syau19 等6 对引物可在11A-47 与橘红色花大白菜基因型中扩增出差异产物，而其余5 对引物则没有扩增出差异产物。由此可见，控制菜薹11A-47 橘红色花的基因与控制大白菜橘红心球色的基因可能不同。

图2 黄色花菜薹×11A-47 6个世代各单株子叶颜色

图3 11A-47 与黄色花菜薹的根部颜色

图4 11A-47 与黄色花菜薹的髓部颜色

图5 11A-47 与黄色花菜薹的花蕾颜色

图6 11A-47 与黄色花菜薹的花瓣颜色

图7 SSR 引物扩增结果

表2 11对SSR 引物的扩增结果

3 结论与讨论

突变体的创建方法主要有自发突变、物理诱变、化学诱变，T-DNA、转座子、反转座子插入等，其中自发突变是自然界普遍存在的变异。在育种实践中，一旦发现了具有某种有利性状的突变体，通过研究其遗传规律并加以应用，最终可选育出具有该性状的优良品种。

3.1 11A-47 突变体的来源

菜薹花色发生自然变异的可能性比较大。笔者发现的橘红色花菜薹突变体11A-47 来源于1份自交2 代的F3菜薹群体。11A-47 突变体除了花色为橘红色外，其余性状与黄色花菜薹相似，其叶色翠绿色，叶形近椭圆形，叶柄长，茎翠绿色，腋芽萌发能力较强；且不具有菜薹与大白菜杂交后代产生的中间性状，如叶翼等。因此，可以肯定地说，菜薹突变体11A-47 的橘红色花基因不是来源于橘红心大白菜，而是菜薹自然突变的产物。在调查菜薹育种材料性状时，除了花色为橘红色的突变体11A-47 外，笔者还发现了以白色为主且嵌有黄色的花色突变体，并可以稳定遗传。

3.2 BC1 群体中橘红色子叶单株存在的原因

本试验是以子叶颜色来确定橘红色花或黄色花单株的。BC1群体中存在极少数橘红色子叶单株的可能原因主要有：① 在调查子叶颜色时，将个别原本为绿色子叶的单株误定为橘红色子叶；② 因F1花粉去雄不彻底而自交，产生少部分F2种子，混在BC1回交群体中。为了重复本试验，笔者还播种了另外2份BC1回交群体，仍然发现具有橘红色子叶的个别单株，橘红色子叶与绿色子叶的比例分别是6∶85 和2∶101。同时，本试验还发现，在盛花期，BC1回交群体依然存在橘红色花的植株，因此，今后的重点是严格拔除F1雄蕊，重新获得BC1群体，并进一步验证上述试验结果。

3.3 菜薹橘红色花基因与大白菜橘红心球色or基因的异同

控制菜薹橘红色花的基因与大白菜橘红心球色or基因的遗传规律一致，即菜薹橘红色花、大白菜橘红心球色均为质量性状，由1对隐性等位基因控制。本试验应用11对与大白菜橘红心球色基因连锁的SSR分子标记对11A-47 进行分析，其中6 对引物扩增的产物能够准确区分11A-47、橘红心球色大白菜，但这6 对引物也可在黄色花大白菜或黄色花菜薹中扩增出相同的产物，即无法将黄色花大白菜、橘红色花大白菜、黄色花菜薹和11A-47 同时区分开。由目前的研究结果初步分析可见，控制菜薹11A-47 橘红色花的基因与控制大白菜橘红心球色的基因可能不同。下一步，将对控制11A-47 橘红色花的or基因进行染色体初步定位，进一步证明二者间的关系。

本试验还发现，PD7413、PD7418、sau（N） 033、syau15、syau19 和ENA21 等6 对引物虽然已被成功用于区分黄色花和橘红色花大白菜基因型，但在本试验中并没有在橘红色花大白菜基因型中扩增出差异产物，可能是由于试验采用的电泳检测方法（丙烯酰胺凝胶和超高分辨率琼脂糖凝胶）不同或这些引物与大白菜橘红心球色or基因连锁的不紧密等原因造成的。

3.4 菜薹橘红色花基因的应用

笔者已经开始利用11A-47 和白心大白菜进行杂交，希望获得表现更优的大白菜橘红心育种资源，并进一步育成橘红心新品种。另外，菜薹的橘红色花基因可以使其根部和髓部变为橘红色，因此采用生物技术方法有可能将该基因转到萝卜等食用根部器官的蔬菜中，创造出更多具有橘红色性状的蔬菜新资源。

耿新翠，沈向群，侯华，洪雅婷，马士芳.2012.橘红心大白菜形态标记的遗传及稳定性研究.中国蔬菜，（6）：21-26.

刘秀村，张凤兰，张德双，杨建平，王美，徐家炳.2003.与大白菜桔红心基因连锁的RAPD 标记.华北农学报，18（4）：51-54.

王国臣，张凤兰，余阳俊，张德双，赵岫云.2007.与大白菜橘红心基因紧密连锁的SCAR 标记.园艺学报，34 （1）：217-220.

于拴仓，于仁波，戚佳妮，张凤兰，余阳俊，张德双，赵岫云.2007.大白菜桔红心or基因的定位研究.中国遗传学会植物遗传和基因组学专业委员会2007年学术研讨会.金华.

张德双，张凤兰，徐家炳.2003.大白菜花色和球色遗传规律的研究.华北农学报，18（2）：81-84.

张德双，徐家炳，张凤兰.2004.不同球色大白菜主要营养成分分析.中国蔬菜，（3）：37.

张华敏，武云霞，张鲁刚，张亚丽.2009.达草灭对橙色大白菜愈伤组织中类胡萝卜素含量的影响.植物生理学通讯，45（4）：340-344.

Bartley G E，Scolnik P A.1995.Plant carotenoid：pigments for photoprotection，visual attraction，and human health.Plant Cell，7：1027-1038.

Feng H，Li Y F，Liu Z Y，Liu J.2010.Mapping ofor，a gene conferring orange color on the inner leaf of the Chinese cabbage（Brassica rapaL.ssp.pekinensis）.Molecular Breeding，DOI：10.1007/s11032-010-9542-x.

Wang Y，Sun S L，Liu B，Wang H，Deng J，Liao Y C，Wang Q，Cheng F，Wang X W，Wu J.2011.A sequence-based genetic linkage map as a reference forBrassica rapapseudochromosome assembly.BMC Genomics，DOI：10.1186/1471-2164-12-239.

Zhang F L，Wang G C，Wang M，Liu X C，Zhao X Y，Yu Y J，Zhang D S，Yu S C.2008.Identification of SCAR markers linked toor，a gene inducing beta-carotene accumulation in Chinese cabbage.Euphytica，164：463-471.