广东东莞畜禽肉制品大肠杆菌O157：H7和沙门菌监测结果分析

洪伟彬，李永福，张险朋，黄炳炽

（广东省东莞市动物疫病预防控制中心，广东 东莞 523086）

无论在发达国家还是发展中国家，由病原微生物引起的食源性疾病已成为影响食品安全的重要原因，给社会和人们健康带来严重危害。沙门菌（Salmonellaspp）、大肠杆菌O157：H7是目前世界公认引起食源性疾病的重要致病菌和人兽共患病原微生物。主要通过食物及饮食、肉及肉制品传播。人感染大肠杆菌O157：H7可致腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征及血栓性血小板减少紫癜等严重并发症，严重者可导致死亡［1］。沙门菌主要引起食物中毒和败血症等。近年来，两种病原体引起的食物中毒事件在世界各地包括我国都有不同规模的暴发流行［2］，造成了严重的经济损失［3－5］。因此，我们必须对这两种病原体高度的重视起来。为保护本市市民的生命健康及公共卫生事业的健康发展，笔者连续

3年来从东莞市32个镇（区）屠宰场和1个冻肉库采集样品，进行大肠杆菌O157：H7和沙门菌污染情况监测，为本市大肠杆菌O157：H7和沙门菌的预防及控制措施的制定提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集 共2 132份，其中猪肝1 868份采自东莞市各镇（区）屠宰场，364冻肉库样品。采样过程中一份样品一套器械，防止交叉污染。

1.2 试剂 沙门菌荧光PCR检测试剂盒（深圳市太太基因工程有限公司，批号：070615，071016，090721）；大肠杆菌O157：H7荧光PCR检测试剂盒（深圳市太太基因工程有限公司，批号：060404，070808，080311，090721）；改良EC 肉汤基础培养基（广东环凯微生物科技有限公司）；缓冲蛋白胨水（BP，广东环凯微生物科技有限公司）；新生霉素购自广东环凯公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.3 仪器设备 高速离心机，ABI7500荧光PCR仪，ECSO生物安全柜，恒温培养箱。

1.4 培养基的配制 改良EC肉汤基础培养基配制：取培养基干粉36.6 g，加蒸馏水1 L，加热煮沸至完全溶解，于112℃，灭菌15 min。分装于广口瓶中，每瓶225 m L，最终p H值6.9。使用前加入新生霉素至终浓度为2μg／m L。缓冲蛋白胨水配制：取培养基干粉20.1 g，加蒸馏水1 L，加热煮沸至完全溶解，于112℃，灭菌15 min。分装于广口瓶中，每瓶225 m L，最终p H值7.2。

1.5 样品增菌

1.5.1 沙门菌增菌培养 无菌操作称取25 g样品加入225 m L BP培养基中，37℃±1℃培养20 h。

1.5.2 大肠杆菌O157∶H7增菌培养：无菌操作称取25 g样品加入改良EC肉汤基础培养基中，42℃±1℃培养20 h。

1.6 DNA制备 取增菌液1 m L加入离心管中，8 000 r／min离心5 min，弃去上清；加入50μL DNA提取液，混匀后沸水浴5 min，13 000 r／min离心5 min，取上清于－20℃保存备用。

1.7 PCR扩增 反应采用25μL体系，反应条件为37℃，5 min，1个循环；95℃，3 min，1循环；95℃5 s，60℃40 s（收集荧光），40个循环。

2 结果

取2μL模板DNA做荧光PCR。2007年～2009年共检测各种肉类2 132份，其中屠宰场样品计1 868份（1 405份样品做沙门菌监测，所有样品都做大肠杆菌O157：H7监测），具体结果见表1；冻肉库 样品264份，具体结果见表2。

表1 2007年～2009年屠宰场猪肝样品大肠杆菌O157：H7和沙门菌检测情况

表2 冻肉库不同冻肉的大肠杆菌O157：H7和沙门菌检测情况

3 讨论

大肠杆菌O157：H7和沙门菌都是重要的食源性病原微生物，感染后会严重的危害人体健康，甚至危及生命。本次调查结果表明，动物产品在屠宰加工、储存过程中都不同程度受到大肠杆菌O157：H7和沙门菌污染。在冻肉储存库的抽查中鸭肉的沙门菌的阳性检出率最高，高达到30.95%，2007年～2009年在屠宰场猪肝的沙门菌阳性检出率分别为10.38%，6.12%，7.01%，年份之间的检出率变化不大，虽然检出率较高，但是否属于致病性沙门菌需要进一步鉴定。在国内肉类沙门菌污染调查中，孙晓林等在2003年～2006年对兰州市生肉致病菌进行调查，其中沙门菌的检出率为5%［6］；孙艳等在2003年对沈阳零售肉类的沙门菌检测中在鸡肉、鸭肉、兔肉样品中的检出率分别是61% ，71%和83%，在猪肉和牛肉中分别是40%和48%［7］。大肠杆菌O157：H7在猪肉中的阳性检出率最高，达到16.47%。在屠宰场猪肝的大肠杆菌O157：H7检出率变化也不大，分别为29.06%，20.27%，22.93%。王建等［8］在2005年对上海市的动物及动物产品进行了调查，大肠杆菌O157：H7阳性率为2.05%，占利等［9］在2007年对年浙江省衢州地区动物中大肠杆菌O157：H7进行了调查，分离率为5.33%。虽然各地的这两种致病菌的带菌率不尽相同，但是从中我们可以看出这两种细菌污染普遍存在。

传统的细菌检测主要靠分离培养和直接免疫荧光等方法，由于方法学本身的原因，其特异性和敏感性均受不同程度的限制，尤其不适合大规模的监测。此次调查采用的方法是先用选择性培养基进行增菌，然后再对增菌液进行大肠杆菌O157：H7和沙门菌荧光PCR检测，大大提高了特异性；该方法检测周期短，2天可以完成初步检测，并且适合大数量样品的检测。使用荧光PCR检测具有防止消除交叉污染，特异性强，敏感度高，定量结果准确等优点。国内也有研究对传统方法和荧光定量PCR方法进行比较，结果发现荧光定量PCR检测方法的符合率为100%，且耗时较短。因此，使用荧光PCR检测方法进行细菌感染调查是今后食品安全部门的一个首要选择。

在动物产品的细菌污染一般分为内源性污染和外源性污染两个方面。所谓内源性污染，是指活畜禽已经患有某种特定的病原菌；外源性污染则是指动物产品在屠宰、加工、运输、储存、销售过程中，受到污水、粪便、加工工具等的污染而感染。本次调查的两种细菌均为食源性疾病，其结果显示，我市在肉类中已普遍存在这两种细菌，这就提示有关监管部门应寻找其受污染的途径和环节。在今后的工作中重点加强对生肉类产品加工、运输、存储、销售过程中的卫生监管以及加强对宿主动物粪便的无害化处理监管，防止带菌动物粪便污染及肉类间、肉类与其他食物之间的交叉污染，减少由此引起的食源性疾病暴发。

通过3年的大肠杆菌O157∶H7和沙门菌监测，证实我市市售肉类制品中不同程度地存在这两种细菌的感染或污染，存在发生大肠杆菌O157∶H7和沙门菌感染暴发或流行的潜在危险。因此，有关部门在今后应进一步加强监测监管工作和健康宣教的力度，以预防和控制疫情的发生蔓延。

［1］Reinstein S，Fox J T，Shi X，etal.Prevalence of Escherichia coli O157：H7in the American bison（Bison bison）［J］.J Food Prot，2007，70（11）：2555-2560.

［2］金宁一，胡仲明，冯书章.新编人兽共患病学［M］.北京：科学出版社，2007：728-739.

［3］陆美娟，胡万富，陶涛，等.安徽省1999-2003年 O157：H7大肠杆菌实验监测及其意义［J］.疾病控制杂志，2005，9（5）：441-443.

［4］刘胜贵，魏 麟.应用PCR技术检测猪肉中沙门氏菌的研究［J］.食品科学，2007，28（3）：254.

［5］王毳，闫磊，曾庆祝.沙门氏菌的检测技术与方法［J］.现代食品科技，2007，23（5），82.

［6］孙晓琳，许敬东，马军武，等.兰州市肉与肉制品微生物污染状况的研究［J］.中兽医医药杂志，2008（3）：22-25.

［7］孙艳，汤雪梅，丛柏林，等.沈阳市零售肉类大肠埃希菌与沙门菌污染调查［J］.中国公共卫生，2005，21（10）：1233-1234.

［8］王建，沈莉萍，刘佩红，等.上海市动物及其产品中大肠埃希菌O157∶H7带菌情况的调查［J］.动物医学进展，2005，26（4）：87-90.

［9］占利，陆群英，程苏云，等.2007年浙江省衢州地区动物中产志贺毒素大肠埃希菌O157∶H7感染状况［J］，中国卫生检验杂志，2008，18（11）：2348-2351.