放疗增强对转染p Ad KDR／CD／TK自杀基因系统的SW480大肠癌细胞的杀伤作用

刘志毅，金 虎，翟春亮，刘 明

（吉林大学第四医院 普通外科，吉林 长春 130011）

目前对大肠癌的治疗，除了外科手术、化疗和放疗外，生物治疗成为研究热点，其中基因治疗研究较多，而自杀基因最为深入。所谓自杀基因就是药物敏感基因，能够将无毒的药物前体在体内转变成有毒的药物杀死肿瘤细胞。该疗法不但能直接杀伤转基因的肿瘤细胞，还可利用其独特的“旁观者效应”杀伤周围大量未转基因的瘤细胞。放射治疗是通过辐射诱导肿瘤细胞原发损伤或者细胞凋亡，从而导致肿瘤细胞的死亡。在放疗过程中，射线不但杀死肿瘤细胞，同时也会对周围正常组织造成损害，而且会随着剂量的增加而加大。研究表明，放射线可以增加基因的转染率［1，2］，增强基因的稳定表达；而自杀基因可以增加肿瘤的放射敏感性［3］。自杀基因联合放疗治疗肿瘤，目前以单自杀基因研究较多，而对双自杀基因的研究刚刚开始，还比较少。本实验用以构建的p KDR－CD／TK融合基因，联合γ射线，进一步探索双自杀基因与放疗对大肠癌SW480细胞的杀伤协同作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

重组腺病毒（recombinant adenovirus with KDR promoder，p Ad Easy－KDR－CD p Ad Easy－KDR－TK p Ad Easy－KDR－CDgly TK）由吉林大学普通外科实验室构建。DMEM、RPMI 1640、MTT、小牛血清（Gibco公司）；转染试剂PolyFect（Qiagen公司）；GCV （Roche Pharma 公司），5－FC（Sigma公司）。

1.2 SW480细胞的培养

①于15 ml锥形试管内加入10 ml PRMI1640细胞生长液。②37℃水浴处理冰冻SW480细胞小瓶40－60 s，并轻轻摇动之，室温下，体积分数70%乙醇浸泡去除污染。③将细胞悬液加入含10 ml PRMI 1640细胞生长液的15 ml锥形试管内，（200×g）离心，5 min，吸除细胞生长液，加入5 ml新鲜细胞生长液。④组织培养瓶，内含新鲜PRMI 1640细胞培养液10 ml，将细胞悬液5 ml加入其中，体积分数5%CO2，37℃孵育；当细胞达到70%汇合时行1∶3传代。⑤吸除PRMI 1640细胞培养液，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）10 ml清洗细胞，用Tyrosine－EDTA 1 ml消化3 min。⑥用新鲜PRMI 1640细胞生长液8.5 ml灭活Tyrosine，将细胞悬液1 ml加入培养瓶内，在加入新鲜PRMI 1640细胞液9 ml，在体积分数5%CO2，37℃下孵育。⑦细胞70%汇合时传代。

1.3 p Ad Easy－CDglyTK，p Ad Easy－KDR－CDglyTK重组腺病毒的转染

先将2份3×105LOVO细胞分别接种于2个10 ml培养皿中，体积分数5%CO2，37℃培养过夜，再分别加入10μl重组腺病毒p Ad Easy－CDgly TK p Ad Easy－KDR－CDgly TK 终 质 量 浓 度 为 mg／L，37℃，体积分数5%CO2培养6 h。之后更换新鲜PRMI 1640细胞培养液，体积分数5%CO2，37℃培养24 h。荧光显微镜下观察转染效果。

1.4 γ射线对重组腺病毒的SW480细胞感染率的影响

取对数生长期的SW480细胞，以1×104／孔的浓度接种于96孔培养板，体积分数5%CO2，37℃培养过夜，待细胞丰度达约90%，加入不同感染复数（multiplicity of infection，MOI）的目的腺病毒（分别加入10、20、50、100、200、300MOI），加少许培养基振荡2－3 h后，补足培养基继续在37℃、5%CO2孵箱内培养，分别用γ射线照射，剂量为1.0Gy，每日照射1 h，分为照射组与对照组，3 d后在荧光显微镜下计数GFP阳性细胞百分比。

1.5 60 Coγ射线对转染重组腺病毒的SW480细胞的杀伤增敏作用

1.5.1 取对数生长期的转染 p Ad KDR／CD／TK SW480细胞，及对照组SW480细胞（未做任何处置），以2×105／L，接种于96孔板上，每组设3个复孔。共分4组：

γ射线的照射的剂量分别为0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5Gy，GCV浓度为10 mg／l，5－FC浓度为100 mg／l，GCV＋5－FC浓度为10 mg／l＋100 mg／l。然后于37℃、5%CO2培养箱内静止培养，4 d后MTT法计算细胞生长抑制率。

1.5.2 取对数生长期的转染p Ad KDR／CD／TK，p Ad KDR／CD，p Ad KDR／TK 的SW480细胞，及对照组SW480细胞（未做任何处置），以2×105／L，接种于96孔板上，每组设3个复孔。共分8组：γ射线的照射的剂量分别为1.0，GCV浓度为10、20、40、60、和100 mg／l；5－FC浓度为：100、200、400、600和1 000 mg／l；GCV＋5－FC浓度为：10＋100、20＋200、40＋400、60＋600和100＋1 000 mg／l。，然后于37℃、5%CO2培养箱内静止培养，4 d后 MTT法计算细胞生长抑制率。

1.6 细胞克隆形成实验检测γ射线增敏作用

将转染p Ad KDR／CD／TK的SW480细胞用胰酶消化，使细胞呈单个悬浮于培养液中。单个细胞百分率在95%以上，将1×105的细胞接种于6孔板中 ，实验分为4组：① 对照组；② 单纯用药组（GCV浓度1μg／ml＋5－FC10 g／ml）；③ 单纯照射组，给予Coγ射线照射，吸收剂量为400cGy；④ 联合治疗组：先加入1μg／mlGCV＋5－FC10 g／mlG处理，后进行照射，吸收剂量为400cGy，置37℃、5%CO2培养箱培养14 d，用PBS小心清洗2遍，空气干燥，甲醇固定15 min，Giemsa染色15 min，流水缓慢洗去染液，再空气干燥，显微镜下计数大于50个细胞的克隆。然后按下式计算克隆形成率：克隆形成率（%）＝（克隆数／接种细胞数）×100%；相对克隆形成率（%）＝（照射组克隆形成／对照克隆形成率）×100%。

1.7 统计方法

实验数据用SPSS11.5软件处理，采取独立样本t检验和单因素方差分析，组间比较用SNK法。

2 结果

2.1 重组腺病毒的PCR鉴定

重组质粒经PCR鉴定，均检测到目的基因表达（见图1）。

2.2 γ射线对重组腺病毒对SW480细胞感染率的影响

分为照射组与对照组，3 d后在荧光显微镜下计数GFP阳性细胞百分比。结果（图2）转染双自杀基因的大肠癌细胞照射组和对照组转染率有明显差异（P＜0.01）。

2.3 前药对γ射线对转染重组腺病毒的SW480细胞的杀伤协同作用

2.3.1 转染p Ad KDR／CD／TK SW480细胞和对照的SW480细胞，均给予GCF＋5－FC和γ射线照射，其生长率如图3。γ射线0.2Gy时，生存率分别为（32.2±4.3）%和（86.6±4.6）%；γ射线0.5Gy时，生存率分别为（11.3±3.1）%和（75.2±4.8）%；γ射线0.8Gy时，生存率分别为（6.5±1.4）%和（68.8±5.2）%；γ射线1.0Gy时，生存率分别为（1.6±0.3）%和（47.2±3.7）%；γ射线1.5Gy时，生存率分别为（0.2±0.06）%和（33.9±2.4%）；提示转染p Ad KDR／CD／TK SW480细胞比对照组对前药＋γ射线更为敏感（各组P＜0.001）。

2.3.2 取对数生长期的转染p Ad KDR／CD／TK，p Ad KDR／CD，p Ad KDR／TK的SW480细胞，及对照组SW480细胞（未做任何处置），分别给予不同浓度GCV、5－FC及 GCV＋5－FC。MTT法计算细胞生长抑制率。结果（图4）：TK＋CD／G＋F组和TK＋CD／G＋F＋γ组比较，前药为10／100时细胞生长率分别为（87.4±5.2）%和（31.2±3.8）%；20／200时细胞生长率分别为（64.9±5.6）%和（23.5±4.1）%；40／400时细胞生长率为（56.2±4.8）%和（19.7±3.2）%；60／600时分别为（33.1±2.6）%和（2.1±0.2）%；100／1000时分别为（20.9±2.3）%和（1.3±0.3）%。两组比较有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 细胞克隆形成实验检测γ射线增敏作用

见表1。单纯用药组和对照组比较有统计学意义（P＜0.01）。联合治疗组和单纯用药组比有显著差异（P＜0.0005）。而联合治疗组（G＋F）与单纯放射组比相对克隆率分别为16.8%和59.6%，联合用药（G＋F）与单药（G）、（F）的相对克隆形成率分别为16.8%和43.8%、46.0%。提示γ射线对联合应用GCV＋5－FC比单独应用GCV或5－FC具有明显的曾敏作用；TK／CD双自杀基因的曾敏作用明显高于单自杀基因TK或CD（P＜0.001）。

3 讨论

研究表明，自杀基因对大肠癌细胞具有杀伤作用［4－8］，Takeharu kanazawa等［9］报道 γ射线照射能够增强TK／GCV在癌细胞中的转染率和表达。本实验利用已构建的Adp KDR－TK／CD腺病毒载体，转染大肠癌SW480细胞，给予前药联合γ射线照射，观察双自杀基因和γ射线照射的协同增效作用。①转染率：用不同的MOI转染SW480细胞，并用γ射线1Gy照射，当MOI值为10、20、50时对照组分别是对照组的10.2倍、5.5倍、2.1倍，说明γ射线照射能明显提高双自杀基因的转染效率，并且MOI值较低时作用明显。其原理可能是因为辐射使受照细胞表面受损及穿孔，引起细胞膜通透性和跨膜电位的改变，便于带负电荷的外源基因主动进人细胞，随着辐射剂量的增加细胞内基因产物的量也相应增加。再有辐射导致受体细胞DNA损伤，从而激活细胞的修复机制，在修复过程中由于剪切和重组的发生，很容易使外源DNA和受体DNA发生重组整合。Stevens等［10］发现用9Gy的γ射线照射可以将质粒载体介导的DNA的初始转染效率提高1400倍。虽然本实验γ射线量较小，但转染率提高也很明显。②自杀基因＋前药对γ射线的增敏作用：转染 p Ad KDR／CD／TK SW480 细 胞／γ 组 和 转 染p Ad KDR／CD／TK SW480细胞／GCV＋5－FC＋γ组相比，分别给予 GCV／5－FC100μg／ml＋1 000μg／ml，当γ射线0.2Gy、0.5Gy、0.8Gy、1.0Gy、1.5Gy其细胞生存率前者分别是后者的2.6倍、5.6倍、7.6倍、20.3倍和141.5倍。其可能的机制是辐射使受照细胞基因转染率升高，DNA受损、断裂，并且射线对处于G1期细胞杀伤作用强，而5－FU对于处于S期的细胞杀伤作用明显；放疗可使药物从受到损伤的细胞中释放出来，因而强化了基因治疗的“旁观者效应”。③γ射线对自杀基因的增敏作用：TK＋CD／G＋F组和TK＋CD／G＋F＋γ组比较，给予γ射线1.0Gy照射，并给予前药GCV＋5－FC分别为10μg／ml＋100μg／ml、20μg／ml＋200μg／ml、40μg／ml＋400μg／ml、60μg／ml＋600μg／ml、100 μg／ml＋1 000μg／ml。两组比较前者的细胞生存率是后者的2.8倍、2.8倍、2.8倍、16倍、16倍。提示自杀基因对γ射线的增敏作用，其机制可能是：前药改变肿瘤细胞敏感性，主要是通过促进促凋亡基因bax的转录、抑制凋亡基因bcl－2的转录，以增强肿瘤细胞对放疗的敏感性；或者使肿瘤细胞阻滞于G1期，而G1后期对放疗敏感，从而提高肿瘤细胞对辐射的敏感性，磷酸化的前体药物搀入DNA中可干扰放射损伤的修复，还可对抗放疗后肿瘤细胞的再增殖。

表1 SW480细胞克隆形成率与相对克隆形成率

综上所述，通过本实验提示我们，自杀基因联合放疗：① 放射线可提高基因转移的效率［11］，因而提高了基因治疗的效果。② 磷酸化的前体药物搀入DNA中可干扰放射损伤的修复。③ 放疗可使药物从受到损伤的细胞中释放出来，因而强化了基因治疗的“旁观者效应”。④ 基因治疗可增强放疗的疗效 ，例如直接杀伤或抑制，肿瘤细胞的基因治疗联合放疗不但能提高肿瘤细胞的杀伤能力，还可对抗放疗后肿瘤细胞的再增殖，从而提高疗效。⑤ 基因治疗可增强放疗的疗效，提高其放射敏感性，减少前药的用量，降低射线照射的剂量，可减轻前药的副作用和正常组织的放射性损伤，为提高放疗疗效提供了可能性。

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