温热对胃癌MKN－45细胞凋亡及基因Bax表达的影响

蒋莉萍，邱 瑜，肖 凤，吴凤珍

（1.吉安市妇幼保健院 病理科，江西 吉安 343000；2.井冈山大学 病理教研室，江西 吉安 343000）

自从1975年在华盛顿召开的第一届国际热疗会议以来，热疗作为一种新的肿瘤治疗方法越来越引起人们的兴趣与关注，唯独热疗不开刀，无副作用，被誉为治疗肿瘤的“绿色疗法”。是继临床上常规抗癌疗法之后的另一种新的抑癌方法［1，2］。目前研究认为，温热刺激能引起细胞凋亡［3，4］，而且温热疗法和免疫、化疗等疗法联合应用，还会提高免疫，化疗等疗法的效果［5，6］。本研究对胃癌 MKN－45细胞采用临床有效且相对安全的43℃作为温热的条件，进行不同时间点的水浴热处理，旨在通过观察温热作用对MKN－45细胞凋亡及Bax基因表达的影响，为临床温热疗法提供一定的理论依据。

1 材料和器材

1.1 材料 人胃癌细胞株MKN－45胃癌细胞由江西省消化系疾病研究所馈赠；0.25%胰蛋白酶、高糖DMEM培养液（美国GIBCO公司）；DMSO（美国Amresco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基公司KGA7031－50）；DEPC（美国 Amresco公司）；Trizol Reagent（美国Invitrogen公司）；700 bp DNA ladder Marker（北京全式金生物技术有限公司）；Bax（上游5′－GGCCCACCAGCTCTGAGCAG－3′，下游5′－GCCACGTGGGCGTCCCAAAC－3′，575 bp）及β－actin（上游5′－TCAGGTCATCACTATCGGCAAT－3′，下游5′－AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA－3′，432 bp）PCR引物（美国Invitrogen公司）。

1.2 器材 超净工作台（新加坡ESCO公司）；二氧化碳培养箱（美国NUAIRE公司）；35 mm玻底培养皿（香港耐思科学有限责任公司）；RT－PCR电泳仪（美国Bio－rad公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

用含10%胎牛血清的DMEM培养液常规培养（37℃、5%CO2饱和湿度）。

2.2 温热实验

对照组37℃常规培养，不给予加热处理，实验组加热温度设置43℃，根据加热时间不同分为0.5 h、1 h、2 h及3 h。将处于对数生长期内的MKN－45细胞常规消化、离心、重悬混匀，计数后，接种于35 mm NEST培养皿，置37℃、5%CO2恒温孵育箱培养至贴壁。用封口膜封口后放入43℃的电热恒温水浴箱加热（温度波动＜±0.1℃）。确保整个培养皿底部平放淹没于水中，将温热处理后的细胞换新鲜的10%FBS－高糖DMEM培养液，并放置37℃、5%CO2恒温孵育箱培养24 h。倒置显微镜下观察各温热时间组胃癌细胞MKN－45的形态改变。

2.3 原位末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡

按本实验2.2细胞样品制备后，将自然晾干的细胞样本（细胞爬片）浸入4%多聚甲醛固定液，室温（25℃）固定30 min，样本片浸入PBS漂洗2次，每次5 min；样本片浸入通透液中，室温促渗5 min，样本片浸入PBS漂洗2次，每次5 min；样本片浸入封闭液中，封闭10 min，样本片浸入PBS漂洗2次，每次5 min；每张样本片上滴加100μl上述配制好的DNaseⅠ反应液，25℃处理30 min，浸入1×PBS漂洗2次，每次5 min；每个样本上滴加50μl Td T酶反应液，加盖玻片放入温盒中，37℃避光反应60 min，反应连接后的样本片浸入PBS漂洗2次，每次5 min，注意避光；每个样本上滴加50μl Streptavidin－HRP工作液，加盖玻片放入温盒中，37℃避光反应30 min，反应连接后的样本片浸入PBS漂洗2次，每次5 min，DAB显色。

凋亡细胞半定量分析：在普通光学显微镜下，每组培养皿随机观察5个视野，每个视野计数500个细胞，以计算平均凋亡细胞数所占百分比作为凋亡指数。

2.4 RT－PCR法检测温热后胃癌细胞Bax的mRNA表达

MKN－45细胞接种于25 cm2培养瓶中，待细胞贴壁长至70%左右，分组温热处理后24 h，将温热处理后的各组细胞用预冷的PBS液洗3次，吸弃PBS液，依次加入Trizol、氯仿、异丙醇等，按常规抽提法提取细胞总RNA。琼脂糖凝胶电泳结果显示RNA的完整性，紫外分光光度法确定RNA的量和纯度。以总RNA为模板按逆转录试剂盒上的说明进行逆转录反应。将扩增的DNA产物与1μl 6×上样缓冲液（0.25%溴酚蓝，50%甘油，10 m M EDTA）混合，加样于含0.5%溴化乙锭的2%琼脂凝胶，100 V电泳15 min，紫外线灯下观察结果。然后用Quantity One4.6.2软件分析灰度值，再计算灰度系数比。

3 结果

3.1 温热后胃癌细胞的形态结构改变

倒置显微镜观察：与对照组相比，温热0.5 h部分贴壁MKN－45细胞出现皱缩，从胞膜伸出胞外的伪足逐渐减少，细胞逐渐变圆，细胞内颗粒成分逐渐增多，细胞漂浮，1 h相对较少，2 h细胞皱缩、变圆、漂浮明显增多，细胞数目减少，3 h大部分细胞出现漂浮现象，提示温热0.5 h、1 h，2 h和3 h可明显杀伤胃癌MKN－45细胞。

3.2 TUNEL检测细胞凋亡情况

利用TUNEL荧光素原位末端标记技术，在荧光显微镜下观察，凋亡细胞呈现黄绿色荧光，而非凋亡细胞不发黄绿色荧光，温热0 h、0.5 h、1 h、2 h和3 h后 MKN－45细胞凋亡率分别为11.3%、42.7%、33.4%、48.8%、44.3%，各温热时间组 MKN－45细胞凋亡率均明显高于0 h时间组细胞的凋亡率（P＜0.01），并且温热1 h后的细胞凋亡率低于温热0.5 h，提示胃癌细胞自身对温热可产生一定的应激能力（表1，图1）。

表1 不同温热时间组胃癌MKN－45细胞的凋亡率

图1 不同温热时间组胃癌MKN－45细胞的TUNEL染色

3.3 RT－PCR法检测Bax的mRNA表达

RT－PCR电泳结果显示，与0 h对照组比较，0.5 h至3 h各温热时间组的细胞Bax的m RNA表达水平均明显升高（P＜0.05）；3 h组达最高峰，1 h组低于0.5 h组；与TUNEL法测凋亡的趋势相一致，提示温热可能诱导胃癌MKN－45细胞促凋亡基因过程中Bax基因激活，从而促进细胞凋亡（图2）。

图2 不同温热时间组胃癌MKN－45细胞Bax m RNA的RT－PCR检测（β－actin为内参照）

3.4 统计分析

应用SPSS13.0统计软件行统计分析，数据均采用均数土标准差表示（±SD），以单因素方差分析（one－way ANOVE）计算多组间差异，两两比较采用q检验，P＜0.05为有统计学差异，P＜0.01为有显著性统计学差异。

4 讨论

热疗是用人工加热的方法治疗恶性肿瘤，利用各种物理能量在人体组织中产生热效应，使肿瘤细胞升温到一定程度并维持一定时间，达到引起癌细胞凋亡和杀灭癌细胞及避免正常细胞遭受损伤的目的，另外热疗可增强免疫治疗和化学药物治疗的效果，所以在目前的肿瘤综合治疗中倍受关注。当前研究表明，温热疗法治疗恶性肿瘤的作用机制主要是：1）改变细胞内环境，妨碍膜转运蛋白及细胞表面受体的功能，直接导致癌细胞的死亡；2）抑制肿瘤血管生成及肿瘤转移［7］；3）可促进免疫细胞包括自然杀伤细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞的活性，促进细胞因子的合成及增强免疫效应，提高机体的免疫功能［8］；4）诱导肿瘤细胞凋亡［9］。有研究表明43℃～45℃温热作用可诱导肿瘤细胞凋亡［10］，但不同类型的肿瘤细胞对热疗的反应和敏感性也存在明显差异［11］。本实验首先采用倒置显微镜观察到温热后MKN－45细胞体积变小变圆，核膜皱缩，核染色质均质化，呈细颗粒状，随着时间的延长，细胞内颗粒成分逐渐增多，细胞凋亡数增加。然后采用TUNEL法检测温热诱导胃癌MKN－45细胞凋亡率情况，随着温热时间的延长，细胞凋亡率也逐渐增加，另外温热1 h细胞活力比0.5 h时略高，提示 MKN－45细胞在热刺激的持续作用下，很可能在1 h进入一个热适应期。而3 h细胞组活力比2 h时略低，考虑随着时间的延长，热刺激3 h细胞组出现了大批细胞的死亡。

Bax是一种Bcl－2家族的前凋亡蛋白，而且是Bcl－2家族中最主要的凋亡基因。一般出现在胞浆中，并作为一种细胞损伤和刺激的传感器。响应损伤和刺激，Bax将重新定位于线粒体表面并破坏在正常状态下抗凋亡的Bcl－2蛋白的功能，可与线粒体上的电压依赖性离子通道相互作用，介导细胞色素C的释放，具有促凋亡作用［12］。在本研究中，温热作为一种应激，为此，我们推测Bax参与温热诱导胃癌细胞凋亡的过程。我们采用RT－PCR法检测MKN－45细胞43℃温热下0.5 h、1 h、2 h和3 h后的Bax mRNA水平的表达情况。与对照组比较，MKN－45细胞各温热时间组Bax mRNA水平的表达明显升高，温热3 h组达最高峰，1 h组低于0.5 h组（P＜0.01）。这与前面的凋亡实验结果相吻合。提示温热可明显抑制胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，并可能是通过上调Bax水平的表达而促进胃癌细胞凋亡。

［1］Dahl O，Dalene R，Schem B C，et al.Status of clinical hyperthermia［J］.Acta Oncologica，1999，38（7）：863.

［2］Wust P，Hildebrandt B，Sreenivasa G，et al.Hyperthermia in combined treatment of cancer［J］.The lancet oncology，2002，3（8）：487.

［3］Klostergaard J，Leroux M，Auzenne E，et al.Hyperthermia engages the intrinsic apoptotic pathway by enhancing upstream caspase activation to overcome apoptotic resistance in MCF－7 breast adenocarcinoma cells［J］.Journal of cellular biochemistry，2006，98（2）：356.

［4］曹智刚，郭启勇，马 力，等.热化疗对人胆管癌细胞增殖和凋亡的影响［J］.中国医学影像技术，2006，2（006）：804.

［5］陈声池，张长其，陈映雪.热疗联合长春瑞滨和顺铂方案治疗晚期非小细胞肺癌临床疗效观察［J］.中华肿瘤防治杂志，2008，15（10）：778.

［6］黄 波，王晓东，郎贤平.热疗联合顺铂对小细胞肺NCI－H446细胞凋亡的影响及机制探讨［J］.山东医药，2012，52（18）：1.

［7］Fukao H，Ikeda M，Ichikawa T，et al.Effect of hyperthermia on the viability and the fibrinolytic potential of human cancer cell lines［J］.Clinica chimica acta，2000，296（1－2）：17.

［8］蔡素霞，田晓予，米建强，等.Tween 80联合42℃温热对人卵巢癌SKOV－3细胞增殖及 HSP70蛋白表达的影响［J］.肿瘤，2009，29（004）：337.［9］Sharif－Khatibi L，Kariminia A，Khoei S，et al.Hyperthermia induces differentiation without apoptosis in permissive temperatures in human erythroleukaemia cells［J］.International journal of hyperthermia，2007，23（8）：645.

［10］HONMA T.Characteristics of hyperthermia－induced apoptotic cell death［J］.Nippon rinsho Japanese journal of clinical medicine，1996，54（7）：1949.

［11］汤 睿，朱正纲，瞿 颖，等.温热体外对人胃癌细胞株生物学行为的影响［J］.世界华人消化杂志，2006，14（2）：144.

［12］崔玉芳，夏国伟，付小兵，等.Relationship between expression of Bax and Bcl－2 proteins and apoptosis in radiation compound wound healing of rats［J］.中华创伤杂志：英文版，2004，6（3）：135.