樟芝固态发酵生产Antroquinonol及萃取Antroquinonl的研究

喻学淳，夏永军，张 欢，许赣荣，张薄博

(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122)

樟芝(Antrodia Camphorata)，又名牛樟芝、牛樟菇、红樟菇等，有“灵芝之王”、“森林红宝石”之称。野生樟芝只生长在台湾本土的牛樟树(Cinnamomum kanehirae)上，通常腐生于上百年的树干空洞内，野生樟芝子实体具有浓郁的樟香气味［1］。樟芝子实体作为传统药物，被台湾土著居民用作治疗疾病的良药。近年来，众多研究表明，已确定樟芝产品具有保肝、抗肿瘤、抗氧化、调节免疫、解毒、抗炎等功效［2］。樟芝子实体具有的这些功效与其含有的众多活性成分有关，其主要活性成分是多种三萜类化合物［3-6］、活性多糖、马来酸和琥珀酸衍生物、泛醌类化合物等［7-9］。Antroquinonol属于泛醌类化合物，具有显著的抗癌活性，并且，它对于肝癌细胞与正常细胞有选择性［10］，目前已进入FDA二期临床实验，是具有优良前景的抗癌化合物。由于牛樟树是台湾特有的珍稀树种，野生樟芝子实体的产量极度匮乏，因此市售樟芝主要来源于人工培养，目前的人工培养方式主要有椴木培养法、固态培养法和液态培养法。椴木培养法仍然受到牛樟树稀有性的限制，液态培养法得到的樟芝产品中的产物活性成分与野生樟芝差别极大，几乎不含Antroquinonol，固态培养可模拟樟芝野生环境且不受牛樟树稀有性的限制，其代谢产物种类更接近于樟芝子实体。但目前国内外对固态发酵培养樟芝的研究比较少，对Antroquinonol的研究都集中在其药理活性上面，除了Lee等［9］首次鉴定出Antroquinonol的研究中，提到过用固态发酵法培养樟芝并用正己烷的方法萃取Antroquinonol以外，专门针对Antroquinonol的固态发酵工艺及提取方法的研究几乎没有。本文通过培养基的优化达到提高樟芝固态发酵中Antroquinonol含量的目的，并通过理论计算、模拟实验，确定了合适的樟芝固态发酵产品中Antroquinonol合适的萃取工艺条件。

表1 培养基优化实验设计Table1 The experimental design ofmedium optimization

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

樟芝菌 上海福茂食品有限公司提供;种子液培养基 种子液培养基成分如文献［11］所示;原固态培养基(1L三角瓶) 谷物原料100g，NH4Cl 0.04g，K2HPO40.025g，MgSO40.025g，初始含水量 50% (g水/g干基)，接种量 30%(m L/g干基)，28℃培养;萃取原料 实验室发酵产品;乙醇 体积分数为95%，国产;乙腈 色谱级，德国Meker公司等。

DKZ-2型电热恒温振荡水槽 上海福玛实验设备有限公司;PL602-S电子天平 梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司;SPX-250B-Z型生化培养箱 上海迅博实业有限公司医疗设备厂;SHB-IIIA循环水式多用真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司;高效液相色谱仪 配有SPD-10AVP检测器，日本岛津公司; Sepax Amethyst C18柱(4.6mm×250mm) 美国赛分公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 种子液培养方法 种子液培养方法如文献［11］所示。

1.2.2 分析检测方法 樟芝产品中的Antroquinonol的HPLC分析方法如文献［12］所示。

1.2.3 培养基优化方法 樟芝固态发酵中各因素的优化实验设计如表1所示。其中，初始含水量包括接种种子液含水、大米含水以及添加水。按式1计算:

1.2.4 固态发酵产物中 Antroquinonol的萃取方法 本实验室最初采用简单接触流程法，该方法各项参数为:体积分数为95%的乙醇与樟芝固态发酵产品的比例为60∶1，50℃水浴振荡萃取1.5h。然而该方法存在着三个方面的缺点:溶剂消耗量大;萃取时间长;产品中的Antroquinonol萃取不完全。因此，本次实验中考虑采用多级逆流萃取代替简单接触流程法。通过实验经验以及相关公式的计算［13-14］，设计逆流萃取的萃取条件为:乙醇与萃取物料比例为10∶1(v/w)，在水浴温度50℃，振荡萃取1h条件下进行三级逆流萃取。预期Antroquinonol的残留率小于1%。实验建立的三级逆流萃取过程如图1所示。根据浸提模型［14］可知，从萃取级数三中得到的第三级萃取 液中 Antroquinonol的 含量 和 残 渣 中Antroquinonol含量的相同。所以，通过标准曲线将第三级萃取液中的Antroquinonl含量换算成相应质量固态发酵产品中Antroquinonol含量，此含量即为残渣中的Antroquinonol含量，可用来计算Antroquinonol残留率。Antroquinonol残留率的计算公式如式(2)

数据430.196(mg/kg)表示样品中Antroquinonol总含量。数据来源如下:在料液比1∶60(m/v)，50℃水浴振荡1.5 h的单级萃取条件下，将一份样品反复用新的萃取液萃取，直至萃取液中检测不出Antroquinonol。通 过 计 算 求 各 萃 取 液 中 的Antroquinonol含量之和，并换算成相应质量固态发酵产品中Antroquinonol含量，既得样品中Antroquinonol总含量。

2 结果与讨论

2.1 固态发酵培养基的优化实验

2.1.1 发酵基质对樟芝固态发酵产Antroquinonol的影响 固态发酵中，一方面发酵基质作为菌体生长的附着物，起着支撑发酵物的作用，影响发酵体系中的传质、传热;另一方面发酵基质作为主要营养物质，为发酵提供主要碳源及复杂的生长因子，影响着微生物的生长、代谢。因此，发酵基质的选择对樟芝固态发酵有着重要的影响。

如图2所示，以5种谷物原料为发酵基质进行樟芝固态发酵，发酵干基中Antroquinonol含量依次为:大米＞糯米＞小米＞高粱＞薏米仁。明显，高粱和薏米仁不适合作为樟芝固态发酵的基质。虽然小米适合用于樟芝固态发酵产三萜类化合物［11］，但并不适合作为产Antroquinonol的固态发酵基质。糯米作为发酵基质所得到的发酵干基中Antroquinonol含量不低，但由于其粘度较大，不利于接种操作。而当大米作为发酵基质时，其发酵干基中Antroquinonol的含量最高，达到608.93mg/kg。并且大米来源广泛，价格低廉，所以大米是樟芝固态发酵产Antroquinonol的最佳发酵基质。以下实验均采用大米作为发酵基质。

图1 樟芝固态发酵产品中Antroquinonol的三级逆流萃取过程Fig.1 The three-stage countercurren extraction process of Antroquinonol in the solid-state fermentation products of A.camphorata

图2 发酵基质种类对樟芝固态发酵产Antroquinonol的影响Fig.2 The effect of fermented grain types on Antroquinonol content by A.camphorata in solid-state fermentation

2.1.2 装料量对樟芝固态发酵产Antroquinonol的影响 樟芝固态发酵采用1L三角瓶作为发酵容器，由于发酵空间有限，发酵基质的装料量对固态发酵过程中的传质、传热有着重要的影响。如果发酵基质装料量过多，发酵培养基太厚，会导致传热困难，培养基中心温度过高，且氧的传质也会受到阻碍，这些因素都不利于菌体的生长及代谢产物的合成。

如图3所示，装料量为 110g/L时，干基中Antroquinonol的含量最高，为635.31mg/kg。当装料量增大到120g/L时，干基中Antroquinonol含量下降了 40.66%。当装料量小于 110g/L时，干基中Antroquinonol含量基本上随装料量的增加而升高。说明装料量过大或者过小都不利于Antroquinonol的合成。所以选择110g/L作为发酵基质的装料量，以下实验中装料量均采用此标准。

2.1.3 初始含水量对樟芝固态发酵产Antroquinonol的影响 固态发酵基质中的含水量对基质的物理特性有着重要的影响［15-16］。含水量过高，会使谷物基质颗粒间的孔隙率减小，从而影响基质的传热、传质;含水量过低，会导致谷物基质颗粒变硬、水活度降低，从而限制微生物的生长。

图3 发酵基质装料量对樟芝固态发酵产Antroquinonol的影响Fig.3 The effect of substrate capacity on Antroquinonol content by A.camphorata in solid-state fermentation

如图4所示，初始含水量为50%时，樟芝固态发酵产品中Antroquinonol含量最高，为544.16mg/kg。含水量高于或低于 50%时，樟芝固态发酵产品中Antroquinonol含量都会受到影响。特别是当含水量太高时，培养基粘度增大，种子液与基质搅拌不均匀，不利于微生物在基质中的生长。所以选择初始含水量为50%进行固态发酵较为合适，后面的实验均采用这一标准。在实验过程中，随着发酵的进行，樟芝菌丝体慢慢地包裹住谷物基质颗粒，利用谷物基质内部的淀粉，使得发酵基质的含水量逐渐升高。在发酵结束时，樟芝固态发酵产品的含水量可达到70%左右。

图4 初始含水量对樟芝固态发酵产Antroquinonol的影响Fig.4 The effect of initialmoisture content on Antroquinonol content by A.camphorata in solid-state fermentation

2.1.4 外加碳源(葡萄糖)对樟芝固态发酵产Antroquinonol的影响 由于固态发酵周期较长，前期很大一部分时间用于菌体的生长，而Antroquinonol是次级代谢产物，如果能缩短菌体生长时间，使发酵周期中更多的时间用于次级代谢产物的积累，就可以缩短发酵周期，提高Antroquinonol的产量。本次实验考虑添加葡萄糖作为樟芝快速生长的碳源，促进樟芝菌的快速生长，缩短发酵周期。

如图5所示，外加葡萄糖的浓度对樟芝固态发酵产品中Antroquinonol的产量有明显的影响。在葡萄糖添加量为 2.0g/L时，樟芝固态发酵产品中Antroquinonol的含量最高，达到650.46mg/kg，因此后续的实验以2.0g葡萄糖/L为外加碳源添加标准。在发酵过程中观察到，樟芝菌覆盖包裹住谷物基质颗粒的时间随葡萄糖的添加而有所提前。

图5 外加碳源(葡萄糖)对樟芝固态发酵产Antroquinonol的影响Fig.5 The effect of supplementary carbon source(glucose) on Antroquinonol content by A.camphorata in solid-state fermentation

2.1.5 氮源含量对樟芝固态发酵产Antroquinonol的影响 谷物基质中以淀粉等碳源物质为主，氮源含量很少，因此需要在谷物基质中添加一定量的氮源，以保障菌体的正常生长。樟芝固态发酵生产三萜类物质的实验中，NH4Cl是最好的氮源［11］，但在樟芝固态发酵生产Antroquinonol实验中，大豆粉是最好的氮源。因此，本次实验考察大豆粉添加量对樟芝固态发酵产Antroquinonol的影响。

如图6所示，氮源添加量从0g大豆粉/L增加到0.1g大豆粉/L，樟芝产品中Antroquinonl含量随之增加。当添加量为0.3g大豆粉/L时，Antroquinnol含量达到最高，为696.83mg/kg。而继续提高氮源添加量，Antroquinonol的含量反而有所下降。所以0.3g大豆粉/L是较为合适的氮源添加量。

图6 氮源含量对樟芝固态发酵产Antroquinonol的影响Fig.6 The effect of nitrogen content on Antroquinonol content by A.camphorata in solid-state fermentation

2.2 固态发酵产物中Antroquinonol的萃取实验

为了从樟芝固态发酵产品中得到更多的Antroquinonol，并为其工业化生产提供理论参考，本实验考察了樟芝固态发酵产品中Antroquinonol的萃取工艺。

三级逆流萃取系统建立后，萃取系统即进入平衡过程，第一次排出滤渣时，对萃取级数一、萃取级数二、萃取级数三各取一个样，标记为取样序列1;其后的每次萃取都同时对萃取级数一、萃取级数二、萃取级数三各取一个样，取样序列依次标记。取样后微滤，用HPLC检测Antroquinonol含量并进行分析，结果如表2所示。

表2 三级逆流萃取中各级Antroquinonol含量及残留率Table2 The content and residual rate of Antroquinonol in each stage of the three-stage countercurren extraction process

在逆流萃取系统建立后的第一次取样时，在取样序列1的一级萃取液中积累了三份样品中的Antroquinonol，所以取样序列1的第一级萃取液中Antroquinonol含量最高，是取样序列2的第一级萃取液中Antroquinonol含量的2.56倍。从取样序列4开始，第一级萃取液中的 Antroquinonol含量在42～50mg/m L之间波动，这种小范围的波动是三级萃取下基本达到平衡后的标志。且从取样序列4开始，Antroquinonol的残留率小于1%，达到预期要求。并且，如表3所示，三级逆流萃取的溶剂萃取能力是单级萃取的溶剂萃取能力的6～7倍，溶剂损失变化不大，Antroquinonol残留率大大减小。因此，采用三级逆流萃取能大大提高萃取溶剂的萃取能力，极大地节约萃取溶剂的用量，这对于大规模工业应用中经济成本的降低具有重大的意义。

表3 单级萃取与三级逆流萃取参数比较Table3 The comparison of parameters between single stage extraction and three-stage countercurren extraction processes

3 结论

经实验比较，确定优化后的樟芝固态发酵产Antroquinonol的固态培养基配方是:1L三角瓶中大米装料量为110g，初始含水量为50%，外加碳源为2.0g葡萄糖，氮源添加量为 0.3g大豆粉。Antroquinonol含量从608.93mg/kg提高到696.83mg/kg，提高14.44%。

经实验发现，用体积分数为95%的乙醇作萃取剂(乙醇与萃取物料比例为10∶1，v/w)，以水浴温度50℃，振荡萃取1h为萃取条件进行三级逆流浸提，残渣中的Antroquinonol残留率小于1%。该法具有溶剂使用量少，萃取效率高的优点。其溶剂萃取能力是原单级萃取的溶剂萃取能力的6～7倍，能极大地降低大规模工业应用中的经济成本。

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