HPLC法测定云南省不同辣椒品种中辣椒碱及二氢辣椒碱的含量

刘 录，陈海云，刘菲菲，姚元成，徐胜平，杨克沙，赵海云，曹建新，*

(1.昆明理工大学化学工程学院，云南昆明 650504;2.云南民族大学化学与生物技术学院，云南昆明 650500)

辣椒(Capsicum frutescence L.)又称辣角、辣子、番椒、秦椒，属茄科辣椒属植物，是人类种植的最古老的农作物之一［1］，它具有体温调节［2］、抗癌［3］，消炎镇痛［4］等作用，不仅可以作为调味品来使用，还可作为菜肴来食用，许多人很喜欢食用。辣椒中具有辣味的物质有十余种，其中辣椒碱(Capsaicin)、二氢辣椒碱(Dihydrocapsaicin)是最辣的成分，这两种物质的含量约占辣椒中辣味物质的90%左右。辣味物质含量越高，辣椒的辣味越强［5－6］。云南地处低纬高原地区，地理位置特殊，地形地貌复杂，海拔悬殊极大，各地气候受海拔和地形影响大于纬度影响，往往同一地区出现不同气候带，全省具有丰富多样的气候类型。这种复杂多样的地理环境和气候条件，分布有大量的辣椒种质资源，是我国辣椒种质资源最为丰富的省份之一［7］。据此，本文通过高效液相的分析方法对云南省不同地区不同品种的辣椒中辣椒碱和二氢辣椒碱含量进行分析检测，拟建立一种快速、准确、高效的分析检测方法及为从植物资源中提取辣椒碱类物质提供了数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

辣椒样品采于云南省红河、河口、丘北、景洪、江那和德宏地区，经云南省农科院园艺所刘发万副研究员鉴定;液相标品:二氢辣椒碱，辣椒碱(纯度均≥98%) 购于成都曼斯特生物科技有限公司。

PE Series 200 LC高效液相色谱仪 美国珀金埃尔默公司;TU－1901双光束紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司;DHG－9240A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司;SB－2000 EYELA旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司;AL204型电子天平 梅特勒－托利多上海有限公司。

无水乙醇、甲酸、乙酸、乙酸乙酯、丙酮、四氢呋喃和磷酸 均为分析纯，购于天津市风船化学试剂科技有限公司;甲醇和乙腈 均为色谱纯，购于江苏汉邦科技有限公司;纯净水 购于杭州娃哈哈集团有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品溶液的提取 对样品进行超声提取［8］，通过单因素实验确定实验的溶剂、提取温度、液固比和超声时间四个因素，并以此为据按照因素水平表1进行四因素三水平的L9(34)正交实验，得到最佳提取条件，液固比:30∶1;提取溶剂:75%乙醇水溶液;提取温度:55℃;超声时间:50min。

表1 因素水平表Table1 The table of the factors and levels

1.2.2 对照品溶液的配制 取辣椒碱和二氢辣椒碱适量，置于干燥器中过夜干燥，精密称定各化合物，用甲醇配制成单品对照品溶液和混合对照品溶液。

1.2.3 样品溶液的配制

1.2.3.1 干辣椒样品溶液的制备［9］将干辣椒在50℃烘干至恒重，粉碎后过60目筛，称取1.0000g于100mL容量瓶中加入30mL乙醇，用保鲜膜封口，用针扎几个小孔，经超声波清洗仪于55℃下超声提取50min，用滤纸过滤后，收集滤液，将滤渣和滤纸重新加入75%乙醇溶液25mL，超声提取20min，再重复1次，将三次过滤收集的滤液合并，用旋转蒸发仪在70℃下浓缩，甲醇定容至25mL，经0.45μm膜过滤，待测。

1.2.3.2 新鲜辣椒样品溶液的制备［9］新鲜辣椒用组织捣碎机捣碎，称取5.0000g，用烘箱在50℃下烘干至恒重。制备方法同上节所述干辣椒样品溶液的制备方法。

1.2.4 色谱条件(样品溶液的提取;色谱条件) 色谱柱 Hanbon Sci.＆ Tech.Lichrospher C18(250×4.6mm，5μm)。检测器:紫外检测器。检测波长:280nm。柱温:30℃。甲醇－3‰磷酸水溶液梯度洗脱(65% ～90%，0～30min)，流速 1.2mL/min。进样量20μL。

1.2.5 计算公式 辣椒碱、二氢辣椒碱得率为提取的辣椒碱和二氢辣椒碱的质量与辣椒样品质量的比值。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 提取溶剂的选择 根据“相似相容”原理，结合辣椒碱及二氢辣椒碱的结构及极性，实验选择甲醇、丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃、50%乙醇、70%乙醇和无水乙醇7种溶剂进行提取。结果表明相同条件下，甲醇对辣椒碱和二氢辣椒碱的提取得率最高，四氢呋喃(THF)次之，70%乙醇溶液与THF相比略有下降，丙酮最低。但鉴于毒性和价格综合考虑，选择乙醇作为提取剂较适宜。

2.1.2 乙醇体积分数的选择 2.1.1中，当乙醇体积分数不同时，辣椒碱和二氢辣椒碱的得率差别较大，为了找到更适宜提取的乙醇体积分数，进一步提高得率，实验选取体积分数为50%～100%的乙醇，相邻间距为10%，重复2.1.1的提取操作，结果表明辣椒碱和二氢辣椒碱的得率与乙醇体积分数呈抛物线变化，在乙醇体积分数在80%附近时，达到最大。因此实验选择80%的乙醇为提取剂。

2.1.3 提取温度的选择 实验中精确称取等质量的辣椒样品，加入25mL浓度为80%的乙醇溶液，分别在30～70℃下，相邻间距为 10℃，超声辅助提取30min，经抽滤、浓缩后定容至 25mL，取适量过0.45μm滤膜，进行HPLC测定。结果表明辣椒碱和二氢辣椒碱的得率与超声温度呈抛物线变化，50℃附近提取率都达到最大，因此，辣椒碱的提取温度控制在50℃左右为宜。

2.1.4 液固比的选择 实验中精确称取等质量的辣椒样品，分别按取液固比(体积:质量)为 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 加入浓度为 80% 的乙醇，在 50℃ 下超声辅助提取30min，经抽滤、浓缩后定容至25mL，取适量过0.45μm滤膜，进行HPLC测定。结果表明随着液固比的增大，相间传质速率增大，辣椒碱和二氢辣椒碱的得率不断增大，当液固比为25∶1后，得率变化不大，综合考虑最佳的提取液固比应为25∶1。

2.1.5 超声时间的选择 实验中精确称取等质量的辣椒样品，按液固比(V:m)为25∶1加入浓度为80%的乙醇，在50℃下分别超声辅助提取20、30、40、50、60min，经抽滤、浓缩后定容至 25mL，取适量过0.45μm滤膜，进行HPLC测定。结果表明超声时间由20min升至30min过程中，辣椒碱和二氢辣椒碱的得率迅速升高，提取时间继续增长，得率变化不大，因此超声提取时间确定为30min左右为宜。

2.2 正交实验

在单因素实验基础上，选取影响辣椒碱和二氢辣椒碱得率的乙醇体积分数、提取温度、液固比和超声时间4个因素，设计四因素三水平的L9(34)正交实验，来进一步优化辣椒碱和二氢辣椒碱的提取工艺，正交实验结果及分析见表2。

由表2可见，以辣椒碱和二氢辣椒碱得率分别为指标时，适宜提取工艺都为:A1B3C3D3，由正交分析知其最优条件均为A1B3C3D3，与正交实验分析所得最优工艺条件一致，所以选择A1B3C3D3为辣椒碱和二氢辣椒碱得率的适宜提取工艺条件，即乙醇浓度为75%、提取温度为55℃、液固比为30∶1、超声时间为50min。

表2 正交实验结果Table2 The results of orthogonal experiment

表3 标准曲线、检出限及定量限实验结果Table3 Results of standard curve，detection limit and quantitation limit

2.3 超声提取次数的确定

精确称取等质量的辣椒样品5份，参照以上得出的辣椒碱和二氢辣椒碱适宜提取工艺分别提取1～5次，HPLC分析结果表明当对辣椒样品进行重复提取时，辣椒碱和二氢辣椒碱的得率有很大升高，但随着提取次数的增加到3次时，辣椒碱和二氢辣椒碱的得率升高不明显，表示辣椒碱和二氢辣椒碱已经接近完全提取，考虑工艺复杂性及经济性，选择提取次数为3次。

2.4 色谱分离参数的确定

2.4.1 检测波长的确定 采用双光束紫外可见光光度计对辣椒碱和二氢辣椒碱进行扫描，扫描波长范围为190～400nm，辣椒碱和二氢辣椒碱均在 λ=280nm处有最大吸收峰，与文献值一致。所以，选择检测波长λ=280nm，对辣椒碱及二氢辣椒碱进行HPLC检测。

2.4.2 流动相的确定 为了获得较好的分离度，通过查阅文献，实验中利用8组不同流动相系统:乙腈－水，乙腈－1‰磷酸水溶液，甲醇－水，甲醇－2.5%乙酸水溶液，甲醇－1‰甲酸水溶液，甲醇－3‰甲酸水溶液，甲醇－1‰磷酸水溶液，甲醇－3‰磷酸水溶液，甲醇－水－磷酸。分别对样品中化合物含量进行测定，通过比较化合物保留时间和峰型，最终选用甲醇－3‰磷酸水溶液系统。将供试品溶液经HPLC进行分析，结果显示:甲醇－3‰磷酸水溶液梯度洗脱(65%～90%，0～30min)，辣椒碱和二氢辣椒碱可获得较好的分离度。

2.5 对照品液和样品液的色谱分离图

取供试样品溶液适量，参照上面所述液相方法进行HPLC分析，记录谱图，如图1所示。供试品色谱图中辣椒碱和二氢辣椒碱的色谱峰分离度及峰形均较好，符合高效液相色谱定量分析的一般要求。

分别取辣椒碱和二氢辣椒碱对照品溶液适量，参照上面同样的液相方法进行HPLC分析，记录谱图，如图1所示。辣椒碱和二氢辣椒碱在色谱图中的保留时间分别为13.2、16.4min，取供试样品溶液2份，分别加入辣椒碱和二氢辣椒碱对照品溶液，摇匀，各取适量经0.45μm膜过滤，经HPLC分析，谱图中对应的色谱峰明显增高。

图1 混合对照品与样品对照色谱图Fig.1 High performance liquid chromatogram of reference substances and samples

2.6 线性关系、定量限及检出限的考察

精密称取辣椒碱、二氢辣椒碱各25.02mg，分别定容至25mL，都配制成浓度为1mg/mL的标准液，用甲醇对标准液进行不同倍数的稀释使浓度分别为0.20、0.10、0.08、0.05、0.02mg/mL。经 HPLC 分析，以对照品的峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果见表3所示。辣椒碱和二氢辣椒碱在各自的线性范围内线性关系良好，线性相关系数均达到0.999以上。

取各单品对照品溶液，用甲醇稀释后进行HPLC分析，调整溶液浓度得出信噪比为3和10时，即可得到样品的最低检出限和定量限，辣椒碱和二氢辣椒碱的检出限和定量限，结果见表3所示。

2.7 精密度及稳定性实验

取适量配制好的混合对照品溶液，用0.45μm滤膜微过滤后进行HPLC分析，连续进样6次，辣椒碱和二氢辣椒碱两种对照品HPLC分析结果相对标准偏差RSD分别为0.46%和0.79%，表明仪器精密度良好，该方法精密度符合要求。

表7 新鲜辣椒中辣椒碱，二氢辣椒碱含量Table7 The content of capsaicin and dihydrocapsaicin in fresh chillies

表8 干辣椒中辣椒碱、二氢辣椒碱含量Table8 The content of capsaicin and dihydrocapsaicin in dry chillies

2.8 重复性实验

取同一供试样品溶液，平行测定6次，考察HPLC测定的重复性，结果见表4，辣椒碱和二氢辣椒碱的相对标准偏差分别为0.57%和0.86%，符合实验要求。

表4 色谱方法稳定性实验结果Table4 Stability of the experimental results of chromatographic methods

2.9 稳定性实验

取某一样品溶液，每2h经HPLC测定一次，测定结果见表5所示。辣椒碱和二氢辣椒碱的相对标准偏差分别为0.54%和0.63%，表明样品在10个小时内稳定性良好。

2.10 加样回收率实验

采用加样回收法，取涮涮辣样品，设计5组平行实验，每组三份分别加入0.10、0.30、0.50mL辣椒碱和二氢辣椒碱对照品储备液，记录峰面积，按线性回归方程计算辣椒碱和二氢辣椒碱的含量，数据结果表明，平均加标回收率在98.58%～99.81%，相对标准偏差为0.47%～0.99%。表明该方法可以满足对辣椒样品的分析测试要求。回收率和相对标准偏差见表6。

表5 样品稳定性实验结果Table5 Experimental results of the sample stability

表6 添加回收率的结果(n=5)Table6 Results of recovery(n=5)

2.11 不同辣椒样品中辣椒碱和二氢辣椒碱含量的测定

按照前面所述样品溶液的制备方法以及HPLC测定方法对15种辣椒中辣椒碱，二氢辣椒碱含量进行测定。结果见表7、表8。

从表7可以看出，对于不同种新鲜辣椒，其辣椒碱和二氢辣椒碱的含量与辣椒所属种类一致，依次为云南本地小米辣＞指天椒(外引种)＞圆锥型，圆锥形辣椒中辣椒碱、二氢辣椒碱含量远低于其它类型的辣椒。

从表8可以看出，对于干辣椒样品，云南涮辣的辣椒碱和二氢辣椒碱的含量远高于其他辣椒品种，各种类型辣椒辣椒碱、二氢辣椒碱含量也与辣椒所属种类一致，云南涮辣远高于其它类型，羊角辣椒含量最低。

从表7、表8可见，中红河县猛龙乡哈龙村、红河县猛龙乡(河坝地区)和小米辣(江那镇羊街)不同颜色辣椒的辣椒、二氢辣椒碱含量差别较大，说明不同成熟期对于辣椒碱和二氢辣椒碱含量影响较大，可以通过采摘期不同来获得辣椒碱类物质含量较高的辣椒。

3 结论与讨论

3.1 本实验确定了辣椒碱和二氢辣椒碱高效液相色谱分析条件，并对色谱分析参数进行优化。采用色谱柱 Hanbon Sci.＆ Tech.Lichrospher C18(250×4.6mm，5μm)分离，甲醇－3‰磷酸水溶液梯度洗脱(65%～90%，0～30min)，检测波长 280nm，辣椒碱和二氢辣椒碱的相对标准偏差都小于1%，平均回收率都在99%以上，表明该方法准确、简便、灵敏，可作为辣椒碱和二氢辣椒碱含量的定量分析方法。

3.2 通过对于提取工艺的考察研究，得出了辣椒碱和二氢辣椒碱的适宜提取工艺条件:提取溶剂75%乙醇溶液;超声温度55℃;超声时间50min;液固比:30∶1;提取3 次。

3.3 通过对云南省不同地区不同品种辣椒中辣椒碱和二氢辣椒碱含量的研究，结果表明干辣椒中云南涮涮辣中辣椒碱和二氢辣椒碱的含量远远高于其它类型;鲜辣椒中圆锥形辣椒中辣椒碱和二氢辣椒碱含量远低于其它类型辣椒;不同成熟期对于辣椒碱和二氢辣椒碱含量影响较大，可以通过采摘期不同来获得辣椒碱类物质含量较高的辣椒。

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