水生生物超氧化物岐化酶的研究进展

张立颖，赵 萌，王跃智

(北京市水产科学研究所，北京 100068)

广泛存在于细胞和组织中的超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)是清除体内超氧阴离子自由基一种重要的酶，它由美国学者McCord 和Fridovich 于20 世纪60 年代末发现［1］。大量的基础和临床研究证实，当受到病毒、细菌入侵时，机体的免疫细胞会产生自由基物质(主要是氧自由基和一氧化氮自由基等)来杀灭细菌病毒，这是免疫反应中重要的一环，但是，当免疫反应过度，自由基产生过量时，它们的非特异反应特性会不加分辨地对受感染机体的生命基本结构分子如蛋白质、核苷酸、脂肪等产生极强的氧化硝化反应，导致对细胞、组织的攻击。

SOD 作为生物体内超氧阴离子自由基的清洁剂，在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能，在医学、食品、化妆品等领域得到越来越多的应用。目前，世界各地学者对SOD 的研究方兴未艾，深入研究SOD 不仅有着重大的理论意义，也有着重大的实际应用价值。不同动物，其SOD 的含量不同，即使同一种动物，其不同组织的SOD 含量也各不相同。通常以肝脏中的SOD 的含量最为丰富。陆生动植物SOD 的研究报道较多，水生生物方面仅有十几个品种的SOD 被研究［2－12］，本文概述了水生生物(如鱼、虾、贝、藻)SOD 的种类分布及研究进展，并对其应用前景进行展望。

1 SOD 的种类及分布

SOD 按其结合的金属离子不同，主要分为Cu/Zn－SOD、Fe－SOD 和Mn－SOD。Cu/Zn－SOD 主要存在于真核细胞的胞液和叶绿体中，呈现蓝绿色，相对分子量约为32 000。它由2 个亚基组成，每个亚基各有1 个Cu2+和1 个Zn2+。Fe－SOD 和Mn－SOD 很相似［13］，但是它们有明显的差异氨基酸以及对H2O2的敏感性［14－15］。Fe － SOD 多见于原核细胞及少数植物细胞中，为黄褐色，相对分子量约为38 700。它是由2 个亚基组成的，每个亚基中各含1 个Fe3+。紫红色的Mn－SOD 在原核生物细胞及线粒体中也比较常见，相对分子量约为40 000。原核细胞中的Mn －SOD 是由2 个亚基组成，而来自真核细胞线粒体中的Mn－SOD，是由4 个亚基组成，且每个亚基各含有1 个Mn2+。20 世纪90 年代，人们又陆续从链霉菌属中发现Ni－SOD 和Fe/Zn－SOD，在牛肝中发现了一种Co/Zn －SOD 等不同的SOD，这些都是少见的SOD。

2 SOD 的结构特征

2.1 Cu/Zn-SOD 的结构特征

不同来源的Cu/Zn－SOD 的氨基酸序列，无论是来自细菌、真菌高等植物细胞质或叶绿体，还是来自高等动物和人的细胞质，它们的同源性都较高，有些氨基酸很保守。在Cu/Zn －SOD 的氨基酸组成中，酪氨酸和色氨酸的含量甚微，甚至没有。而甘氨酸含量较高，每6 ～8 个氨基酸残基中就有1 个甘氨酸残基。1975 年Richardson 得到了Cu/Zn－SOD 的三维结构［16］，发现它是由2 个基本相似的亚基组成的二聚体，且每个亚基含有1 个铜原子和1 个锌原子。2 个相同亚基之间通过非共价键的疏水相互作用而缔合，类似于圆筒的端面。Cu 与4 个来自组氨酸残基(His44，46，61，118)的咪唑氮配位呈现1 个三角双锥畸变的四方锥构型，Zn 则与3 个来自组氨酸残基(His61，69，78)的咪唑氮和1 个天门冬氨酸残基(Asp81)的羧基氧配位，呈畸变的四面体构型。

2.2 Fe-SOD 的结构特征

不同生物来源的Fe－SOD 一级结构同源性较低。Phalgun 等［17］比较了7 种嗜盐古细菌家族的Fe－SOD，在199 个氨基酸中有125 个氨基酸完全一致(62%)，而它们与真菌和真核线粒体Fe －SOD 相比只有35% ～40%的同源性。但Donatella 等［18］研究了真核细胞Tetrahymena pyriformis 的四聚体Fe －SOD 并测序，氨基酸序列分析表明，与其它来源的Fe －SOD 相比，具有较低的同源性(33% ～34%)。Barry 等［19］认为对Fe－SOD 结构最有意义的特征之一是高度保守的芳香族氨基酸含量，特别是在活性部位的氨基酸残基。占17%的蛋白序列的33 个保守氨基酸残基分别是His、Tyr、Phe 和Trp，活性部位Fe 的 8A 范围内发现 5 个保守氨基酸残基，分别为 Tyr34、Tyr77、His30、Trp123 和 Trp158，其中，Trp 和Tyr34 存在于所有接近金属开放结合位置。另外，在所有的Fe －SOD 中都存在严格保守的Gln70 和Tyr34 之间的相互作用，这对残基之间的相互作用在酶的化学性质、结构及催化动力学方面都起着重要的作用，并与酶的金属特异性相关。

到目前为止，发现Fe－SOD 具有二聚体和四聚体2 种形式。每一种形式都由各自相同的亚基组成。高嗜温性菌株S.solfataricus 的Fe－SOD 晶体结构显示，在每一对称亚基中含2 个相同单体，形成一个紧凑的四聚体，与来源于结构分支杆菌的嗜温性SOD 相比，在亚基之间的Fe 离子对的数量增多。电子数据显示在活性部位保留氨基酸Tyr 残基上存在特别的共价修饰。这可能与酶特殊高嗜温性相关［20］。

2.3 Mn-SOD 的结构特征

任何生物来源的Mn－SOD 的一级结构的同源性都很高。如人Mn －SOD 和鼠、大肠杆菌的Mn －SOD 的同源性分别为94%和43%，不仅如此，参与形成活性中心及与金属连接的氨基酸在所有Mn －SOD 中都是保守的，而且与金属锰相连的氨基酸在所有Mn －SOD 中也是保守的，它们是His26、His87、His181 和Asp185。Mn－SOD 的CD 谱表明，其含有较高程度(大于32%)的α 螺旋结构，较少β 折叠。由一级结构预测的二级结构表明，Mn－SOD 中不可能存在象Cu/Zn －SOD 那种八股反平行的β 折叠，也不存在长的松散环，整个结构比较紧凑。电子自旋共振(ESR)和核磁共振(NMR)研究揭示Mn－SOD中的金属离子是处于高度自旋状态的3 价锰Mn3+。Mn－SOD 的金属辅基上结合有1 个水分子。金属辅基对蛋白质结构有稳定作用，而且与Mn－SOD 的活性直接相关。

Mn－SOD 的活性中心都是具有五配位的三角双锥结构，其中一个轴向配体为水分子，来自蛋白质辅基的4 个配位基为His28、His83、Aspl66 和His170。后3 个配位基位于赤道平面，His28 的咪唑基则占据着另一个轴向位置。活性部位处在一个主要由疏水残基构成的疏水壳子里，两个亚基链共同开成一个通道，该通道终止于金属离子附近的Try36 和His32 残基，是底物或其他内界配体接近Mn2+离子的经由之路。His33、Trp37、His83 和Tyr36 形成一个疏水口袋，该口袋构成底物结合部位。

3 SOD 的理化性质

SOD 是一种酸性蛋白，在酶分子上共价连结金属辅基，因此它对热、pH 以及某些理化性质表现出异常的稳定性。

3.1 温度对SOD 的影响

温度是生物生存环境的重要因素之一。因为细胞膜的成分中含有脂类，所以温度过高或过低都会对细胞膜系统造成影响，进一步破坏细胞内的蛋白质和DNA 等。SOD作为一种细胞膜保护酶在温度胁迫下发挥作用。SOD 酶活性在适宜温度范围外随温度和时间的变化而下降，仅在适宜温度范围内趋于稳定，表1 是不同来源SOD 酶的熔点温度(范围)。

3.2 pH 对 SOD 的影响

SOD 在 pH5.3 ～ 10.5 内其催化速度不受影响。如 pH3.6，SOD中 Zn 要脱落 95% ，pH12.2，SOD 的构象会发生不可逆的转变，从而导致酶活性丧失。SOD 对pH 的稳定性同样归因于金属辅基的存在，一旦去除金属离子，其稳定性就大大下降。实验表明，不同来源的SOD，其等电点pI 值也不相同，见表2。

3.3 SOD 的紫外吸收

SOD 具有特殊的光吸收，Fe－SOD 不含Cys，而含有较多的Trp 和Tyr，不同来源的Fe－SOD 的吸收峰为 278 ～280 nm［21－22］。且 Cu/Zn － SOD 的紫外吸收峰在 260 nm 附近［23］，Mn － SOD 的吸收峰为 280～282 nm，不同来源SOD 的紫外吸收值见表3。

3.4 酶活性

SOD 是金属酶，在Cu/Zn－SOD 酶中，Cu 与Zn 的作用是不同的，Zn 仅与酶分子结构有关，而与催化活性无关，而Cu 与催化活性有关，透析去除Cu 则酶活性全部丧失，一旦重新加入，其活性又可恢复。同样，在 Mn － SOD、Fe － SOD 和 Ni － SOD 中，Mn、Fe 和 Ni 与 Cu 一样，对酶活性是必需的。不同来源SOD 的紫外吸收值见表4。

3.5 分子量

Cu/Zn－SOD 是一个二聚体，均含有2 个相同的亚基，每个亚基有一个Cu2+和Zn2+，全酶分子量一般为31 ～33 ku，亚基分子量为15 ～17 ku。Mn－SOD 的相对分子量随来源不同而异，来自原核生物的Mn－SOD 相对分子量约为40 ku，由2 个亚基组成，每个亚基各含有l 个Mn2+，其分子量为19 ～21 ku，来白真核生物线粒体的Mn －SOD，相对分子量为80 ku，由4 个亚基组成，每个亚基分子量为19.5 ～21 ku。Fe－SOD 广泛存在于原核生物中，按其结构可分为两类，一类是分子量约为40 ～50 ku 的二聚体，亚基分子量约为20 ～26 ku;另一类是分子量约为80 ～90 ku 的四聚体，其亚基分子量约为23 ku。不同来源SOD 酶及其亚基的分子量见表5。

表1 不同来源SOD 的熔点温度(温度范围)Tab.1 The denaturing temperature of SOD from different sources

表2 不同来源SOD 的等电点Tab.2 The pI of SOD from different sources

表3 不同来源SOD 的最大紫外吸收值Tab.3 The maximum ultraviolet absorption value of SOD from different sources

表4 不同来源SOD 酶比活力Tab.4 The enzyme specific activity of SOD from different sources

3.6 金属离子对SOD 活性的影响

不同浓度的金属离子对SOD的活性有着不同的影响，在低浓度下，它可以提高SOD 的活性，而在高浓度下，SOD 的活性将显著下降。张尔贤等发现 0.02 mol/LKCN 30 μL即可使鲨鱼肝脏SOD 酶活性被抑制50%。王伟伟发现 Ca2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+4 种金属离子对 3 种虾肌肉组织中SOD 活性则是低浓度起促进作用，高浓度具有明显的抑制作用，但抑制程度不同。此外，郜赵伟等［24］发现，Zn2+、Cd2+对南方鲶(Silurus meridionalis)肝超氧化物歧化酶活性有强烈的抑制作用;而张迎梅等［25］研究重金属胁迫对泥鳅肝胰脏超氧化物歧化酶活性的影响，得出Zn2+对超氧化物歧化酶有一定的激活作用。

4 SOD 基因的克隆表达

随着生物技术的快速发展，很多种类的SOD 基因的克隆和分离已经获得成功，并且具有生物活性。郭建军等［26］根据SOD 的蛋白质保守序列，以念珠藻Fe －SOD 基因序列为基础设计引物，通过PCR 扩增得到钝顶螺旋藻的Fe － SOD 基因。通过测序发现此基因长528 bp，含有1 个ORF(open reading frame)，编码170 个氨基酸残基。IPTG 诱导表达表明，Fe －SOD 融合蛋白实现了高水平表达，在最佳表达条件37 ℃、1 mmol/L IPTG 浓度、诱导表达5 h 后，其外源基因表达量占全菌蛋白的78%，刷新了原核表达SOD 高产的新记录。这是我国首次利用基因工程方法获得Fe －SOD。这也为进行螺旋藻SOD的基因的克隆和表达奠定了坚实的基础。

目前，包括鱼类在内的大型水生生物的内脏通常都被丢弃，没有充分利用。从目前的研究中可以看到水生生物具有很高的SOD 活性，SOD 具有抗衰老、抗炎、抗疾病、抗辐射等多种作用。用鱼类在内的大型水生生物的内脏为原料，开发一种新的SOD 制剂，既可变废为宝，又可减轻环境污染，将很有发展前景。

表5 不同来源SOD 酶及其亚基的分子量Tab.5 The molecular weights of SOD and their subunits from different sources

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