添加不同碳源渥堆发酵普洱熟茶香气成分的研究

高 力，刘通讯

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

普洱茶是以云南大叶晒青毛茶（Camellia sinensis（Linn.）var.assamica（Masters）Kitamura）为原料，经湿热和微生物一系列生化反应形成的具有独特陈香和多种保健功能的后发酵茶[1]。普洱的陈香品质不仅影响着消费者的选择追求，也主导着其市场价格[2]。

研究表明普洱独特的香味是在渥堆工序中，普洱内质成分在一定的湿热、酶促、微生物作用形成的[3]。不同储存年份[4]、不同的干燥方式[5]、外源酶处理[2]、接种有益微生物[6]对普洱的香气成分都有很大的影响。研究发现，通过添加外源碳源有助于提高普洱发酵过程中的霉菌数及多酚氧化酶活，缩短发酵周期。本文通过对添加木糖、蔗糖、果胶三种不同单糖、双糖、多糖发酵出的成品茶，采用同时蒸馏萃取联合气质联用（SDE-GC-MS）法测定普洱茶香气成分，探讨其对普洱熟茶香气上的影响。为添加外源碳源促进普洱发酵，改善普洱品质进一步提供的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

渥堆原料 云南腾冲大叶六级晒青毛茶，2012年；木糖、蔗糖、果胶 纯度＞99%，上海博奥生物科技有限公司。

Trace DSQⅡGC/MS气相色谱-质谱联用仪 美国Thermo fisher公司产品；HP-5弹性石英毛细管柱（30m×0.25mm，0.25μm） 美国安捷伦科技公司；ESJ200-4电子分析天平 上海精科电子有限公司；氮吹仪；同时蒸馏萃取器；电热套；水浴锅。

1.2 实验方法

1.2.1 原料准备 空白样、添加木糖、蔗糖、果胶（添加比例为0.4%wt）样在实验室渥堆发酵24d后自然晾干所得，发酵方法参考冯超浩等[7]的方法。发酵时间为2012年11～12月，香气测定时间为2013年1月。

1.2.2 SDE提取方法 称取普洱茶粉状样50g置于1000m L圆底烧瓶，加入200m L去离子水，另取二氯甲烷30m L置于250m L单颈圆底烧瓶中，两烧瓶分别接在同时蒸馏-萃取装置两端，用电热套加热，两边达到平衡回流稳定后，萃取2h，萃取液用无水硫酸钠脱水干燥后过滤，氮吹仪挥发溶剂，浓缩得1m L淡黄色透明液体，过0.45μm膜，用气质联用仪进行检测。

1.2.3 GC-MS条件 GC条件：采用HP-5MS弹性石英毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；进样口温度为220℃；载气为He，纯度＞99.999%，流速1.0m L/min；进样口温度250℃，固相微萃取进样脱附5m in。程序升温：50℃保持3m in，以2℃/m in升至125℃，保持5m in，以6℃/m in升至180℃，保持3m in，以15℃/m in升至250℃。

MS条件：轰击电子能量：70eV，电子源电离方式：EI，离子源温度：200℃，进样量：1μL，扫描范围：29～550amu，扫描方式：全扫描。

1.3 GC-MS分析

由GC-MS得到的质谱数据利用W iley及NIST两个数据库进行串联检索，并与文献值对照相结合进行人工解析。以各香气组分的峰面积占香气总峰面积之比值表示组分相对含量。

2 结果与讨论

2.1 添加不同碳源发酵的普洱茶的香气组成

空白组和添加不同碳源发酵的普洱茶的CG-MS图谱解析结果如图1所示。因烷烃类对香气的贡献微弱，故将其略去[8]。由表1可以看到，共检测出103种香气成分，按照香气物质的结构分，有17种醇类、22种醛类、23种酮类、8种酯类、9种杂环化合物、9种碳氢类化合物、11种苯环化合物和4种甲氧基苯化合物。蔗糖组检出的香气成分最多有76种、空白组最少为66种。木糖组、果胶组均检出72种。由表1和图1可知，虽然各组分检出香气数量差不多，但成分差异较为明显。从香气类型看，果胶组主要以醛、酮、烯烃为主，其他各组均以醛、酮、醇类为主。添加碳源的各组醛类、酮类、杂环化合物均高于空白组，木糖组醛类、酮类化合物最多，蔗糖组杂环化合物最多有3.75%。蔗糖组的芳环化合物最多，有9.2%，果胶组烯烃类含量明显高于其他各组，为19.12%。四个组分的甲氧基苯类总量均较少，在1.23%～4.16%之间。

续表

续表

2.2 醇类化合物

由表1可知，空白组、木糖组、蔗糖组和果胶组分别检出13、11、14、11种醇类，且空白组醇类含量最多。各组芳樟醇、芳樟醇氧化物Ⅱ、α-杜松醇、雪松醇、α-松油醇等萜稀类化合物含量均较高，其中空白组最为显著，有6.77%、3.68%、1.45%、2.63%、3.29%。木糖组萜稀醇类含量最丰富。已知芳樟醇等单萜醇类是在酶的作用下通过水解香气前体物质配糖体而生成[9]。所以这种差异可能来自于添加碳源后普洱发酵过程中的酶系变化。与木糖和果胶组相比，蔗糖组还含有2.11%橙花叔醇、0.22%羽扇豆醇、0.44%桃金娘烯醇、0.67%薄荷醇，类别更丰富。构成醇类组要成分的这些单萜醇（芳樟醇、芳樟醇氧化物Ⅱ、香叶基芳樟醇、橙花叔醇）及倍半萜醇（杜松醇、雪松醇）等大都带有浓郁的甜香、花香和木香[6]。

2.3 醛、酮、酯、杂环化合物和苯环化合物

醛的阈值一般很低，对茶叶香气贡献较大。有脂肪香和甜味，其来源于脂质的降解，也有一些来自还原糖和氨基酸的Maillard反应[10]。木糖组的醛类化合物含量最多（37.00%），空白组最少（26.16%），蔗糖组检出的醛类最丰富有17种，空白最少有12种。各组中含量较丰富的几种醛类为5-甲基呋喃醛（焦糖香、咖啡香和辛香）、己醛（清香）、十六醛（花和蜡香）、苯甲醛（杏仁香）、苯乙醛（花香）、天然壬醛（果香）。

图1 不同处理后的普洱茶香气组成图Fig.1 Aroma compositions of Pu-erh tea with different treatment

图2 不同处理渥堆过程堆温变化Fig.2 Pile temperature of Pu-erh tea with different treatment

木糖组和蔗糖组的酮类含量最高，分别为24.06%、26.12%，其中5-甲基-2-（1-甲基乙基）-2-环己烯-1-酮在各组中含量均较高，在4.78%～6.87%之间，它与异福尔酮结构相似，具有樟脑和薄荷香。植酮（青叶香气和果香味）、茶香酮（甜木香）、异福尔酮（薄荷和樟脑香），这些典型的香味酮含量也较为显著。木糖组和蔗糖组β-紫罗兰酮（紫罗兰花香）含量较高，分别为3.01%、2.26%，而在空白组和果胶组中未检测到，已知β-紫罗酮为类胡萝卜素的氧化降解过程产生的初级氧化产物，还可进一步氧化为酯、酮类物质[11]，其氧化程度不同造成各组有差异。蔗糖组还检测出0.41%优香芹酮（留兰香型），果胶组检测出0.22%法尼基丙酮（果香味）。

表1中杂环化合物均为含氧、氮杂环化合物，这类化合物有烘炒香，虽相比于醛、酮类含量较少，但贡献很大，是影响普洱陈香的一类重要香气[12]。添加碳源的各组杂环化合物含量均高于空白组，蔗糖组、果胶组含量最高，分别为5.32%、5.42%，主要有2-乙酰基呋喃、吡咯、2，6-二甲基吡嗪、4a，5，6，7，8a-六氢化-2，3，5，5，8a-五甲基-4氢-苯并吡喃和吲哚。其中吲哚作为普洱茶陈香成分在很低的含量下具有很强的花香味[13]。

各组检出的酯类不多，且含量较少。直链酯类居多，具有代表性的是二氢猕猴桃内酯（果香）、邻苯二甲酸异丁基酯。空白组和添加碳源各组都检出了多种苯环化合物，空白组主要有3.17%甘菊蓝、1.24%甲苯、1.01%苯酚，木糖组主要有1.25%菲、1.03%甘菊蓝和0.9%1，2，3，4-四氢化-甲基-8-（1-甲基乙基）-萘、蔗糖组主要有3.68%苯酚、2.40%甘菊蓝、1.65%甲苯，而果胶组主要有1.19%甲苯、1.13%菲和0.67% 1，2，3，4-四氢化-甲基-8-（1-甲基乙基）-萘。

比较空白组和添加碳源的各组可看出，空白组检测出的香气组分中，其醛、酮、杂环化合物的数量和含量均少于添加碳源各组，特别是杂环化合物的含量，这可能是添加碳源后促进了茶叶中氨基酸与糖类物质发生Maillard反应。原利男等[14]通过葡萄糖和氨基酸加热进行茶叶烘干模拟实验，产生了呋喃、吡咯、吡嗪、苯酚及这几种成分的甲基、乙基、羟基、醛基、乙酰基衍生物和乙酸等。倪德江[15]认为水分和温度是影响糖氨化合物形成的主要因子，在一定温度下，高温促进糖氨化合物的形成，过高温度将降糖胺化合物。任洪涛等[16]实验表明芳香族化合物的含量随发酵程度的不断加深而发生很大变化，发酵过度的普洱茶其主要的芳香族化合物的相对百分含量是适度发酵的近4倍。说明温度和发酵程度对普洱的香气成分影响很大，各组普洱渥堆发酵温度如图2所示，相比空白组，添加碳源各组的渥堆温度较高，蔗糖组在发酵过程中的平均堆温最高，其次是果胶。良好的渥堆温度，为Maillard反应提供了很好的条件，促进了醛、酮和杂环化合物的生成，同时，渥堆温度不同，造成了各组的发酵程度不一样。

2.4 烯烃化合物

由表1可知，各组共检测除了9种烯烃化合物，空白组、木糖组、蔗糖组和果胶组分别检出5、5、3、6种。主要是环蒜头稀、雪松稀、杜松稀等半倍萜稀，其中各组分的环蒜头稀都非常丰富，果胶组尤为显著，达14.16%。这与张灵枝等[5]的发现相同。Buttery R G[17]、Mariotti J P等[18]分别在玉米叶和岩蔷薇中检测出了此种香气成分，前者发现这种微量的香气成分虽然很少，但其独特的香味对小昆虫类具有吸引作用。雪松稀、杜松稀也是常见的普洱茶陈香的提供者[19]。果胶组中还有其他各组没有的右旋柠檬稀和长叶松萜稀。

2.5 甲氧基苯类化合物

与张灵枝等[5]研究相似，各组检出的甲氧基苯类化合物相对较少。这可能与实验所用普洱茶陈放的时间有关。1，2，3-三甲氧基苯和3，4，5-三甲氧基甲苯除蔗糖组中的含量分别在2.06%、1.39%，其他各组这两种成分在1.0%、0.5%左右。空白组和蔗糖组还检测出了丁香子酚（4-烯丙基-2-甲氧基苯酚），木糖组有少量异丁香子酚。川上美智子[20]研究认为，甲氧基苯类化合物的生成，是由于普洱茶中的EGCG在氧化降解过程中脱没食子酰基形成没食子酸，没食子酸的羟基（-OH）的氢被（-CH3）取代，实现甲基化而产生甲氧基苯的类似结构化合物，整个过程由微生物催化完成。添加碳源后，提高了渥堆温度，改变了发酵过程微生物生长环境，也可能改变了EGCG的氧化速度和氧化途径，进而影响甲氧基苯化合物的形成。

3 结论

添加外源碳源进行发酵，提高了普洱发酵过程的平均渥堆温度，促进了Maillard反应，从而丰富了香气种类，增加了醛、酮、呋喃、吡啶等化合物的形成。

各组分之间的主要几种香气成分差异不大，但其他微量香气成分差异明显。各组含量较高的几种香气成分为5-甲基呋喃醛、芳樟醇、5-甲基-2-（1-甲基乙基）-2-环己烯-1-酮、环蒜头稀。蔗糖组有多种其他组没有的成分，如羽扇豆醇、桃金稀醇、天然葵醛、优香芹酮等。木糖组的醛类含量最多，果胶组的烯烃种类最多。普洱中的香气种类繁多，其香气是多种成分共同作用的结果，添加不同碳源发酵的普洱茶中香气组成、比例不同，其香气表现各具特色。

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