酶改性大豆分离蛋白的研究进展

刘少博，陈复生，刘昆仑，布冠好，徐卫河，周迎春

（1.河南工业大学粮油食品学院，河南郑州450001；2.河南工业大学化学化工学院，河南郑州450001）

大豆分离蛋白是经稀碱溶液浸提处理脱脂豆粉，分离出残渣，在蛋白质提取液中加酸至等电点，沉淀出大豆蛋白，对沉淀经过碱中和、喷雾干燥后得到的制品[1]。大豆分离蛋白的蛋白含量高达90%以上[2]，主要是球蛋白，其中7Sβ-伴球蛋白和11S大豆球蛋白占总含量的67%左右[3]，也含有少量的其他蛋白质。大豆蛋白的营养价值从必需氨基酸组成上而言，和动物蛋白相近，除了含硫氨基酸比较缺乏外，其他氨基酸含量很丰富，尤其是含有大量的赖氨酸，基本上不含纤维素、抗营养因子等物质。因此，大豆分离蛋白是优质的植物蛋白质，具有很大的发展潜力。

大豆分离蛋白的溶解度较高，具有一定的乳化性、起泡性、持水性、胶凝性等功能特性，在食品中的应用范围极其广泛。但这些特性不是很理想[4]，很难满足现代食品工业发展的需要，因为工业生产中往往要求大豆分离蛋白达到某种最佳功能或者兼具上述几项功能特性平衡点的产品，因此需要对大豆分离蛋白进行改性，从而在一定程度上提高大豆分离蛋白的功能特性，以满足人们的各种需求。常用的改性方法主要有：物理改性、化学改性和酶改性，其中酶改性是一种比较有潜力的改性方法。

1 大豆分离蛋白酶改性的特点

酶改性之所以是蛋白质改性中不可或缺的方法，主要是因为酶改性与物理改性和化学改性相比较，具有以下几个方面的优点：a.安全可靠：酶改性过程中，一般不会对氨基酸的化学结构产生作用而使其变化，所以大豆分离蛋白酶改性所导致的安全问题基本上可以忽略，且蛋白质的水解产物也容易被人体消化吸收[5]；b.作用温和：酶对蛋白质的作用十分温和，除对蛋白质进行深度水解外，基本不破坏蛋白质原有的功能性质，因为深度水解后的蛋白质的功能特性往往因为高级结构的破坏而下降[6]；c.专一性强：对于特定的功能性质，可以通过一种蛋白酶对某一种或一类蛋白质发生作用进行控制改性，不会破坏蛋白质的其他功能性质；d.效率高：当酶在最适条件下反应时，酶的催化反应速度可以达到非酶促反应的108～1011倍，可以极大的降低能耗，提高反应效率[7]。但是由于酶活力不够高、稳定性较差等因素，未能满足某些应用的要求。

2 酶改性常用的酶及其分类

可用来进行酶改性的蛋白酶种类很多，按其来源分类如表1所示。

表1 酶改性中几种常用的酶及其分类Table1 Several commonly enzymes used in the enzymaticmodification and their classification

3 酶改性的作用机理

酶改性主要是利用酶制剂使蛋白质的氨基酸残基和多肽链发生变化，引起其结构上的改变，从而达到改善蛋白质功能特性和营养特性的目的。蛋白质在酶改性过程中主要有以下变化[8]：a.极性基团（如-NH2+、-COOH-等）数目增加，电荷密度增大，从而使改性后的蛋白质亲水性增强；b.蛋白质分子发生降解，肽链长度缩短，多肽链的平均分子量降低；c.蛋白质分子的构象发生变化。按照酶对大豆分离蛋白的作用机理，酶改性的方式主要有共价交联作用、水解作用、脱酰胺作用和磷酸化作用等[9]。

3.1 共价交联作用

共价交联作用是通过酶试剂在蛋白质内部多肽链之间（分子内交联）或蛋白质分子之间（分子间交联）形成的共价键，导致蛋白质的分子结构发生改变[10]。研究表明，蛋白质在经过酶促共价交联作用后，往往能够比改性前表现出较高的乳化性和持水性等[11]，这可能有助于改善食品品质。目前可以催化蛋白质发生交联作用的酶主要有转谷氨酰胺酶、多酚氧化酶和过氧化酶[12]。

3.2 水解作用

在众多的蛋白质酶改性方法中，研究最多最常用的就是酶对蛋白质的水解作用。其作用机理是利用酶制剂在适宜的条件下催化水解蛋白，使其肽键断裂，生成水解产物，从而达到蛋白质改性的目的[13]。其作用机理如图1所示。

图1 蛋白质酶水解示意图Fig.1 Reaction scheme of enzymatic proteolysis

酶的水解作用能引起多肽链的平均分子质量降低，肽链长度缩短，蛋白质极性基团数目增加，疏水基团暴露，从而有助于改善大豆分离蛋白的功能特性和营养价值[14-15]。目前主要使用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶及碱性蛋白酶等进行催化水解作用。

3.3 脱酰胺作用

脱酰胺作用也是大豆分离蛋白改性中的一个常用方法。就是氨基在酶催化水解作用及水作为质子供体和亲核试剂的条件下被释放出来[16]。其作用机理如图2所示。

图2 蛋白质酶脱酰胺作用的示意图Fig.2 Reaction scheme of enzymatic deamidation

蛋白质去氨基以后，羧基暴露出来，负电荷数量增加，从而可以改善大豆分离蛋白的溶解性、起泡性、乳化性等功能性质。目前主要用于脱酰胺作用的酶有转谷氨酰胺酶、肽谷酰胺酶和谷氨酰胺酶[17]。

3.4 磷酸化作用

酶磷酸化改性是指在蛋白质侧链上特定活性基团（如Ser、Thr、Tyr的羟基），分别和一个磷酸基团接合，使之变成Ser（Thr）-PO的结构，从而接入大量的磷酸根基团，使其功能特性得到改善[18]，是一种有效的改善食品蛋白质功能特性的方法。蛋白质的酶磷酸化改性有很多的优点[19]：反应条件温和、反应位点高度专一、副反应较少、能量和营养损失少等，是食品酶改性中热点。目前用于磷酸化作用的酶主要是蛋白激酶。

4 酶改性对大豆分离蛋白功能性质的影响

在酶的作用下，稳定大豆分离蛋白空间构象的作用力会发生变化，改性后的大豆分离蛋白相对于原有大豆分离蛋白的功能特性有显著的变化。

4.1 溶解性

大豆蛋白的溶解性直接影响其功能性质[20]。大豆分离蛋白主要是球蛋白，其非极性基团朝向分子内部，极性基团朝向分子表面，可以与极性分子相互作用，这使得大豆分离蛋白极易溶于水，但是大豆分离蛋白在食品加工中由于热等因素的影响而发生变性，溶解度显著下降，进而影响其胶凝性、乳化性和持水性等功能特性[21-22]。

董文宾等[23]采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶对大豆浆料进行酶解，发现蛋白酶的水解作用对大豆蛋白的凝胶性能不利，但是可显著提高大豆蛋白的溶解性。为了使大豆分离蛋白添加到酸性食品中，黄橙子等[24]利用植酸酶对其改性，结果表明，当植酸酶添加量为0.6%时的酶解最佳条件为：pH为3.0，温度40℃，料液浓度10%，酶解时间45min，此条件下大豆分离蛋白的酸溶度达到45.79%，比优化前提高了30.65%。Tsumura等[25]在不同pH条件下用胃蛋白酶选择性水解大豆分离蛋白中的球蛋白，结果发现，在pH7.0、8.0时，用胃蛋白酶处理后的球蛋白水解液喷雾干燥粉的溶解度比没处理的大豆分离蛋白低约10%，这可能与酶催化球蛋白水解后，球蛋白内部的疏水性氨基酸残基暴露出来有关。

4.2 乳化性

天然大豆分离蛋白乳化性有限，需通过改性来提高其乳化性，增大其在食品体系中的应用。据报道，在加盐和酸性条件下，通过肽谷酰胺酶对大豆水解物的脱酰胺作用，可提高其乳化性[26]。慈峰等[27]利用木瓜蛋白酶对大豆分离蛋白进行改性，在底物浓度为6%，酶质量分数为0.15%条件下，酶解0.5h，大豆分离蛋白溶液的乳化活性和乳化稳定性分别提高了20%和18%。王月等[28]利用中性蛋白酶对琥珀酰化大豆分离蛋白进行酶改性，确定了最优酶改性条件：pH为6.82、温度为48℃加酶量为6627U/m L，此条件下，琥珀酰化大豆分离蛋白的乳化性提高了3.89倍。

Chen等[29]用复合的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和弹性蛋白酶对预先经过双螺杆挤出机挤压处理的大豆分离蛋白进行改性，使该大豆分离蛋白水解液（水解度9.1%）具有很好的乳化稳定性，可静置放置21d。徐莹等[30]利用转谷氨酰胺酶交联木瓜蛋白酶酶解大豆分离蛋白，然后用其产物改善蛋白质的乳化特性，发现水解度为6%～10%时，大豆分离蛋白样品交联后聚集程度低，冷藏不会明显损坏样品的聚集和聚结稳定性，非常适合用于对乳化特性要求较高的冰淇淋等冷冻食品中。吴琼等[31]在改进冰淇淋生产工艺中，利用转谷氨酰胺酶对大豆分离蛋白的乳化特性进行改性，发现改性后冰淇淋与普通冰淇淋相比，奶粉、乳化剂和稳定剂的用量降低，在提高了冰淇淋的营养价值的同时，降低了生产成本，具有很好的应用前景。

4.3 保水性和吸水性

大豆分离蛋白添加到肉制品，糕点等食品中，能够增加其吸水及保水能力，对产品性质影响很大。段春红等[32]研究证明：添加1.5%菠萝蛋白酶限制性水解的7S球蛋白（水解度6%），肉肠得率达到最大值，为95.65%，这与7S球蛋白改性后持水性的提高有很大关系，为猪肉肠制品的开发提供一些参考。谷氨酰胺转氨酶以大豆分离蛋白为底物应用于肉制品中，可催化蛋白分子或多肽链之间发生共价交联，形成牢固的空间网格，具有很强的保持水的能力，从而防止肉制品在加工过程中皱缩，提高产品嫩度[33]。郭永等[10]用中性蛋白酶和谷胺酰转氨酶复合对大豆分离蛋白进行改性，发现改性后保水性和吸油性比改性前分别提高了173%和35%。张海均等[34]利用转谷氨酰胺酶聚合改性大豆分离蛋白，使蛋白质网状结构更加稳定，不利于和水分子结合，导致吸水性显著（p＜0.05）下降。这说明，对大豆分离蛋白进行保水性和吸水性方面的改性，对改善食品品质具有很大的意义。

4.4 胶凝性

胶凝性使大豆分离蛋白具有较高的黏弹性、并具有一定可塑性。Tang等[35]提出了一种用转谷氨酰胺酶催化形成大豆分离蛋白乳化液凝胶的新工艺，在酶量很低（1.0U/g）的情况下即能产生强度很大的凝胶，并且大豆分离蛋白乳化前经酶预处理（15～60m in）可以极大改善凝胶的性质。赵新淮等[36]研究发现，大豆分离蛋白经胰蛋白酶限制酶解至水解度为1%时，凝胶强度比酶解前增大了大约四倍；此外，蛋白质的酶水解模式和水解度影响产品的凝胶性。杨淼等[37]以大豆分离蛋白为原料，发现转谷氨酰胺酶的共价交联作用在不同油相下形成的乳液凝胶性能差异较大，高油相下，酶的共价交联以及油滴对网络结构的填充作用导致了凝胶强度增大。Tang等[38]利用转谷氨酰胺酶对大豆分离蛋白进行改性时发现，通过调节大豆球蛋白/β-伴球蛋白比例，可改变大豆分离蛋白乳液凝胶的性质。Fang等[39]研究了碱性蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶和木瓜蛋白酶对大豆蛋白分散凝胶性质的影响，发现木瓜蛋白酶处理后的大豆分离蛋白凝胶强度最大，凝胶速度最快，其次是碱性蛋白酶，中性蛋白酶最末。

5 大豆分离蛋白酶改性中存在的问题及发展方向

酶改性是制备改性蛋白的重要手段[40]，对大豆分离蛋白进行酶改性的研究，已经取得了一些成果，其功能性质得到显著改善，极大地促进了食品工业的飞速发展。

但酶改性仍存在一些问题，有待进一步研究，主要表现为：从酶种类上来说，植物蛋白酶来源少、效率比较低、不适应工业化生产；动物蛋白酶量有限、价格昂贵、副反应较多且提取工艺复杂；而微生物蛋白酶来源比较广泛、生产技术日趋成熟、价格也逐渐的降低，从生产成本和经济效益上来说，微生物蛋白酶是比较理想的酶源，以后会重点开发。从酶改性的机理上来说，对整个酶解反应过程中蛋白质一级结构改变的研究还很少。从多种酶协同作用上来说，今后的研究方向趋向于多元化。单一的酶改性技术已经逐渐完善，但难以达到改性的目的，而不同酶之间的复配可能会改善多方面的功能性质，因此利用多种酶复配改性大豆分离蛋白将会成为今后的研究趋势。

除此之外，通过基因工程可以对生物的基因进行改造[41]，这也为我们提供了一个思路：可以利用基因工程技术对产酶生物的基因进行定向改造，从而得到对大豆分离蛋白进行改性的特定酶类，满足食品工业的需要。

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