超高压技术对草莓汁果胶甲酯酶钝化作用的研究

张波波，王 丹，马 越，张 超，赵晓燕，霍乃蕊，*

（1.山西农业大学食品学院，山西晋中030801；2.北京市农林科学院蔬菜研究中心、果蔬农产品保鲜与加工北京市重点实验室、农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室、农业部都市农业（北方）重点实验室，北京100097）

草莓果实多汁，甜酸可口，含有丰富Ca、P、K等元素，并且还富含多种有益生物活性物质[1]。但是草莓易腐烂及易形成机械损伤，不耐运输及贮藏，对其进行深加工，如加工草莓汁等不仅可以充分有效利用草莓，而且可以进一步提高其附加值[2]。杀菌灭酶过程是制作草莓汁必须经历的步骤，热处理可以有效杀灭草莓汁中微生物及钝化内源酶[3]，然而传统热杀菌会造香气损失或产生异味，甚至破坏草莓中维生素C及其他生物活性物质。超高压技术是非热杀菌的新技术，其利用100～1000MPa高压作用影响细胞的形态，改变维持物质分子立体结构的氢键、离子键等一些非共价键[4]，达到杀菌灭酶目的，已被证明可以较大程度地维持原始产品性质[5-6]。

草莓中含有多种内源酶，这些内源酶的存在影响草莓及其制品的风味、颜色及稳定性等品质[3，7]。其中草莓中的果胶甲酯酶与果实软化有很大关系，其与果胶半乳糖醛酸残基C6处羧基发生作用，导致果胶去甲酯化，催化果胶生成果胶酸及甲醇[8]，影响果汁浑浊稳定性，因此钝化果胶甲酯酶对保持草莓汁贮藏期间粘度、质构等品质有深远意义。由于超高压技术的非热杀菌性质使超高压可以尽量保持草莓制品原始性质，并且起到杀菌灭酶作用，因此是草莓汁加工的一种潜在的有效方法。刘野等[9]研究认为，随处理压力升高，超高压技术对PME酶钝化效果越好，Lacroix等[10]研究表明经50℃预热10m in，在pH 3.75～4.0时，橘子汁PME酶对超高压处理非常敏感。Nguyen[11]研究认为从草莓汁中提取的PME酶经超高压处理，随处理压力升高，酶活被钝化程度加深。目前对于不同压力、不同时间、不同温度、不同处理次数超高压处理对调配草莓饮料体系中的PME酶钝化效果的系统研究较少。由于PME酶活性与超高压处理压力、时间、温度及体系pH等都有很大关系，本研究系统考察不同超高压处理对pH 3.95的调配草莓汁饮料体系中PME酶的钝化效果，旨在为调配草莓汁产品的生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

草莓 品种为丰香，购买于农贸市场；果胶裂解酶（10000PECTU/m L） 诺维信（中国）生物技术有限公司；抗坏血酸 天津市弘喜泰化工贸易有限公司；胭脂红 上海染料研究所有限公司；CMC 新乐市润沣化工商贸有限公司；EDTA 汕头市龙湖区万吉工业区海河路中段；山梨酸钠 南通奥凯生物技术开发有限公司；黄原胶 山东阜丰发酵有限公司；柠檬酸（≥99.5%） 北京化工厂；果胶 美国Sigma公司。

FPG7100型超高压实验处理装置 英国STANSTED公司；FT74X-40-44-A型超高温瞬时灭菌仪 英国Arm field公司；NS1oo1L2K型高压均质机 意大利GEA Niro Soavi公司；T65D型高速剪切机 德国IKA公司；TZ3230电位自动滴定仪 德国SCHOOT公司；打浆机。

1.2 实验方法

1.2.1 草莓汁的制备 新鲜草莓-80℃冻藏→去萼→蒸馏水清洗→4℃解冻12h→打浆→加果胶裂解酶（加酶量0.1%、酶解温度50℃、酶解时间3h）→灭酶（条件85℃，5min），四层纱布过滤→调配（后放入4℃冰箱冷藏待超高压及UHT处理）。

配方：酶解草莓汁20%、抗坏血酸0.05%、胭脂红0.0025%、CMC 0.1%、EDTA 0.01%、山梨酸钠0.025%、黄原胶0.05%；将上述溶液使用果葡糖浆将糖度调节为7.5°；柠檬酸调节pH至3.95。将以上物质混匀，缓慢倒入溶液中，搅拌至溶解，若仍有大量不溶物，则高速剪切5m in，待气泡消去后，进行两次高压均质，第一次30MPa，第二次50MPa，以增加果汁稳定性。

以按上述配方调配后，未进行灭菌处理的草莓汁为对照组。

1.2.2 草莓汁的超高压处理 用聚乙烯塑料袋对草莓汁进行真空密封，包装好后放入超高压装置的反应釜内。在30℃协同，处理20min时，考察200、400、600MPa对酶的钝化作用。并分别考察30℃协同400MPa时，20、40、60m in处理及10、20m in 2次处理对酶钝化作用；400MPa处理20m in时，30、45、60℃处理对酶的钝化作用。处理结束后冷却至室温。

1.2.3 草莓汁的UHT处理 调节设备参数126℃处理15s，冷凝水（75±1）℃，待稳定后，将草莓汁倒入UHT物料仓，及时进行无菌灌装并迅速冷却至室温。

1.2.4 PME酶活性的测定 参照Kimball等[12]的方法，稍作修改。

1.2.4.1 底物溶液的配制 10g/L的果胶溶液，含有0.1mol/L NaCl（在大烧杯中量取900m L左右蒸馏水，放于50℃磁力搅拌器上进行搅拌加热，缓慢将10g果胶以及5.85g NaCl倒入温水中，使之充分溶解，待溶液冷却后定容为1000m L，用一定浓度NaOH溶液将果胶溶液调节pH为7.5后放于4℃冰箱贮藏待用）。

1.2.4.2 酶活测定 取40m L的10g/L果胶溶液于（30± 1）℃，恒温水浴。加入1.6m L（V1）果汁，以0.05mol/L（C）的NaOH调节混合液pH7.5，加入0.02m L（V2）0.05mol/L NaOH，开始计时，记录体系回到pH 7.5的时间（t）。PME活性以（U/m L）计。

1.2.5 贮藏期 处理后草莓汁需要放于10℃冷库，贮藏30d。检测贮藏0、30d的酶残余活性。

1.2.6 数据分析 采用SPSS 17.0进行因子方差分析及Ducan’s多重检验（p＜0.05）。所有处理均重复三次，实验结果以均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 不同超高压压力处理及UHT处理对调配草莓汁PME酶钝化作用研究

由不同处理压力实验结果分析，200MPa及400MPa处理与UHT对PME钝化效果一样，考虑到600MPa处理所需成本较大，而前期实验表明200MPa处理不能有效杀灭草莓汁中微生物。因此选择400MPa进行以下实验。2.1～2.4均为刚处理后，贮藏0d时的酶活情况；2.5为贮藏30d后酶活情况。

图1 不同超高压处理及UHT处理对调配草莓汁PME酶残余活性的影响Fig.1 Effectof different pressure（HP）processing and UHT processing on strawberry juice residual PME activity

由图1可知，以对照组草莓汁PME酶活为100%，四种处理草莓汁PME酶活性与对照组相比都显著降低（p＜0.05）。UHT处理与200MPa及400MPa处理对PME钝化程度相当，残余活性分别为79.5%、83.3%及72.1%，显著高于600MPa处理。

超高压处理压力升高至600MPa处理对PME酶钝化最强，达到约52.2%，与较低两个压力处理相比差异显著（p＜0.05）。该结论与李艳霞等[13]结论相似，其认为较低压力处理荔枝果肉，PME酶蛋白发生可逆变性，并出现活性上升，较高压力处理PME酶才开始钝化。刘野等[9]研究认为经超高压处理后，6.69μmol/L PME纯酶溶液的活性随着处理压强的升高而下降，实验最高压力600MPa，60min处理时，PME酶的活性残存率为25.6%达到最低水平。另外Hayakawa等[14]认为静态超高压钝化内源酶活性原因是由于对较弱疏水键的影响使蛋白结构部分解连或分子重排，形成只具有部分活性或无活性中心的结构，对蛋白的解连或重排作用更明显。因此超高压处理压力越高，蛋白活性中心改变更大，更易造成内源酶钝化。

本研究结果600MPa处理20m in PME残余活性约52.2%与刘野等研究结果相比相对较高，其原因可能是与刘野研究的处理体系不同，刘野研究超高压对纯酶溶液的钝化效果，而本研究对象为调配草莓汁。另一个可能的原因是本实验以完成调配的草莓汁为对照，调配草莓汁与鲜榨草莓汁相比PME活性仅有23.47%，并且酶处于食品体系中较难钝化。

2.2 不同超高压处理时间及UHT处理对调配草莓汁PME酶钝化作用研究

图2 不同超高压时间处理及UHT处理对调配草莓汁PME酶残余活性的影响Fig.2 Effect of different dwell time（HP）processing and UHT processing on strawberry juice residual PME activity

图2表示，UHT及不同超高压处理时间与对照组相比都可以钝化PME活性（p＜0.05）。UHT处理与20min处理对PME钝化程度相当，而延长时间（40～60m in）处理与UHT处理相比对PME钝化显著增强（p＜0.05）。

超高压处理时间由20m in延长到40m in对PME钝化并无增强，而60min处理与20min处理相比，60min处理对PME钝化显著增强（p＜0.05），与本实验结果类似，徐增慧等[8]研究表明400MPa，20m in高静压处理与400MPa，30m in处理桃汁PME酶活性基本无差异。随超高压保压时间在较小范围内延长，PME酶活性升高或基本不变。

本研究结果产生的原因可能是与生物大分子结合或与膜结合的酶分子随着处理时间延长20m in至40min逐渐解离，被释放于草莓汁体系与游离的被超高压钝化的PME酶量刚好达到动态平衡；也可能是由于草莓汁经调配后与鲜榨汁相比PME酶活性剩余较少，基数小不易钝化；或者是超高压处理使调配草莓汁产生PME同工酶[15]，与被超高压钝化的酶量达到平衡，因此该时间段内超高压处理对酶的钝化效果并没有因处理时间延长而增强，而60m in处理与20m in处理相比可以使之活性降低（p＜0.05），其原因可能是由于较长时间处理打破了由于超高压钝化的酶与新释放的酶的平衡。

2.3 热协同超高压处理及UHT处理对调配草莓汁PME酶钝化作用研究

图3 不同热协同超高压处理及UHT处理对调配草莓汁PME酶残余活性的影响Fig.3 Effectof thermal synergy ultrahigh pressure processing and UHT processing on strawberry juice residual PME activity

通过图3可知，三种温度协同超高压处理及UHT处理与对照组相比都导致PME显著钝化。而随着协同温度上升，PME酶残余活性基本无变化。该现象的原因可能有两种：a.由于调配后草莓汁与鲜榨草莓汁相比PME活性剩余较小，中温协同超高压并不能对PME酶钝化产生较强影响；b.由于在30℃处理时，PME酶活性已经达到该压力及保压时间条件下最小值，PME酶的残余活性由其他条件（超高压处理压力、处理次数及体系pH）决定。

2.4 不同超高压处理次数及UHT处理对新鲜调配草莓汁PME酶残余活性的影响

从图4可知，超高压压力400MPa，协同温度30℃，20m in处理1次、10m in处理2次、40m in处理1次及20m in处理2次对PME酶钝化作用并没有区别，其原因可能与2.2及2.3所述原因相似。刘建华[16]认为增加超高压处理次数会增加内源酶的解离程度，并且第一次处理解离程度最大，然而由于该实验对照组酶活性仅占鲜榨草莓汁PME酶活性的23.47%，导致增加超高压处理次数只能引起很少的甚至不能使草莓汁破碎细胞附着的PME酶释放。

2.5 贮藏后调配草莓汁PME酶残余活性的变化

由图1～图4可知，贮藏30d后，发现UHT处理及不同超高压处理PME酶活分别与各自0d贮藏相比并无显著差异。然而UHT处理贮藏30d样品与60℃协同400MPa超高压处理20m in贮藏30d样品相比PME活性较高（p＜0.05），说明虽然60℃协同超高压处理与UHT相比在刚处理后不能有效钝化PME，但可以有效钝化贮藏期PME活性。

图4 不同超高压处理次数及UHT处理对调配草莓汁PME酶残余活性的影响Fig.4 Different ultrahigh pressure batch number and UHT processing on strawberry juice residual PME activity

3 结论

3.1 UHT处理及不同超高压处理与对照组相比都可显著钝化草莓汁PME活性。

3.2 600MPa（30℃，20min）处理，40～60min（30℃，400MPa）处理，60℃协同（20m in，400MPa）超高压处理及增加超高压处理次数与UHT处理相比对PME的钝化显著增强。

3.3 超高压处理压力升高至600MPa与较低压力400MPa相比能有效钝化PME活性；超高压处理时间延长至60m in与处理20m in相比可有效钝化PME活性；30～60℃协同超高压处理PME钝化程度无显著区别；处理时间一定，增加超高压处理次数不能有效钝化PME活性。可知，增大处理压力及延长处理时间对调配草莓汁PME钝化有深远意义。

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