正交设计优化新疆药桑桑叶总生物碱超声提取工艺

刘一衡，杨 玲

（1.塔里木大学生命科学院，新疆阿拉尔843300；2.新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆阿拉尔843300）

新疆药桑属桑科，桑属，黑桑种（Morus nigra Linn.），原产于伊朗，16世纪传入我国，主要栽培于新疆南部的广大地区[1]。新疆药桑是我国唯一的黑桑种桑树品种，也是自然界极为罕见的具有22倍体桑树种质资源[2]。桑叶中的生物碱是一类以1-脱氧野尻霉素（DNJ）为主的多羟基哌啶类化合物，DNJ具有与α-1，4-葡萄糖类似的结构，拥有强烈的α-葡萄糖苷酶抑制活性和非常低的细胞毒性[3-4]，因此具有较好的降血糖作用，可用于治疗糖尿病、肥胖症等疾病[5]。

新疆药桑在新疆南部干旱地区长期栽培过程中，为了适应当地极端干旱少雨的自然环境，其形态特征、基因类型、生化及酶学特征等与其他桑种存在着显著差异[6]。黑桑中生物活性成分的种类和含量也与其他产地的桑树品种存在一定差异[7]。国内外对桑属植物的研究主要集中于桑（Morus alba L.），黑桑研究较少。因此，本实验采用正交实验设计，以新疆药桑桑叶总生物碱含量为指标，对总生物碱的提取工艺进行优化，旨在为新疆药桑总生物碱的提取提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新疆药桑桑叶 由当地维医和塔里木大学生命科学院杨玲老师鉴定；乙醇、硅钨酸、盐酸等 均为国产分析纯。

FA1104电子分析天平 上海仪器天平厂；电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；FZ102植物粉碎机 上海锐丰仪器仪表有限公司；KQ5200DB数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

表1 L16（45）正交实验因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal test

1.2 实验方法

1.2.1 单因素实验 将干燥的新疆药桑桑叶在植物粉碎机上粉碎，制成药桑桑叶干燥粉。根据实验按需称取10g药桑桑叶干粉若干份，在提取温度60℃，料液比1∶15，超声波功率600W，乙醇浓度60%的基础条件下分别设置不同提取时间（10、20、30、40、50、60min）、提取温度（40、50、60、70、80、90℃）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35）、超声功率（300、400、500、600、700、800W）以及乙醇浓度（0%、20%、40%、60%、80%、100%），进行单因素实验。

1.2.2 新疆药桑桑叶生物碱待测液的制备 根据单因素实验结果，以总生物碱含量为实验指标，进行L16（45）正交实验，正交实验因素水平表见表1。

1.2.3 新疆药桑桑叶总生物碱含量的检测 采用硅钨酸沉淀法[8]，将样品待测液加盐酸调至pH 2.0左右，逐滴加入10%硅钨酸溶液至沉淀完全，静置至溶液澄清，用定量滤纸（干燥至恒重）滤过，沉淀干燥至恒重，精密称重。总生物碱按桑叶特征生物碱1-脱氧野尻霉素（分子式为C6H13NO4，分子量为163）计，总生物碱含量（mg·g-1）=沉淀重量（mg）/桑叶重量（g）×0.1856（理论换算因数=4R/SiO3·12WO3·4R·2H2O=0.1856）。

2 结果与分析

2.1 药桑桑叶总生物碱提取的单因素实验

2.1.1 提取时间对总生物碱含量的影响 由图1可知，总生物碱含量随提取时间的增加而总体呈现增加的趋势，可见提取时间越长总生物碱提取的越充分。但为了节约时间，选取20、30、40、50m in为正交实验的四个水平。

图1 提取时间对总生物碱含量的影响Fig.1 Effectof extraction time on the contentof total alkaloids

2.1.2 提取温度对总生物碱含量的影响 由图2可知，总生物碱含量随温度的增加呈现先增加后减少的趋势。当温度低于70℃时，总生物碱含量随着温度的升高而增加，这是因为随着热效应的增加，分子运动加快，有利于总生物碱的溶出；当温度超过70℃时，部分生物碱高温分解造成总生物碱含量随温度升高而下降。因此选择50、60、70、80℃作为正交实验中的四个水平。

图2 提取温度对总生物碱含量的影响Fig.2 Effectof extraction temperature on the contentof total alkaloids

2.1.3 料液比对总生物碱含量的影响 由图3可知，当料液比高于1∶15的时候，总生物碱含量随料液比的降低而增加；当料液比低于1∶15的时候总生物碱含量随料液比的降低而降低。这是因为料液比高于1∶15时，随着料液比增加，溶剂量增加，两相间的浓度差增加，有利于总生物碱的扩散溶出；当料液比低于1∶15的时候，总生物碱基本溶出，而溶剂增加会造成浓缩和过滤时的损失，从而导致总生物碱含量下降。因此，选取1∶10、1∶15、1∶20和1∶25四个水平进行正交实验。

图3 料液比对总生物碱含量的影响Fig.3 Effectof solid-liquid ratio on the contentof total alkaloids

2.1.4 超声功率对总生物碱含量的影响 由图4可见，总生物碱含量整体随着超声功率的增加而升高，这可能是因为随着超声功率的增加，超声波的空化作用和剪切作用增加，有利于细胞壁的粉碎，从而使生物碱的溶出增加。因此选用500、600、700、800W作为正交实验的四个水平。

图4 超声功率对总生物碱含量的影响Fig.4 Effectof ultrasonic power on the contentof total alkaloids

2.1.5 提取溶剂对总生物碱含量的影响 由图5可见，在乙醇浓度低于60%时，总生物碱含量随乙醇浓度增加而升高；而乙醇浓度高于60%时随着乙醇浓度的增加总生物碱含量反而下降。乙醇浓度在40%～80%之间时，总生物碱含量较高，考虑到增加乙醇浓度会增加生产成本，所以选择20%、40%、60%和80%作为正交实验的四个水平。

图5 乙醇浓度对总生物碱含量的影响Fig.5 Effectof ethanol volume fraction on the contentof total alkaloids

2.2 正交实验

根据单因素实验结果可知，提取时间、提取温度、料液比、超声功率以及乙醇浓度都会影响总生物碱的提取效果。为确定这5个因素的综合影响，选取对总生物碱含量有意义的水平进行正交实验，采用L16（45）正交实验，实验结果见表2。

由分析结果可知，各因素对总生物碱提取的影响主次顺序为C＞E＞D＞B＞A，即料液比＞乙醇浓度＞超声功率＞提取温度＞提取时间。方差分析（表3）表明料液比对总生物碱提取有着极显著意义，乙醇浓度对总生物碱提取有着显著意义。因此优选出来的最佳总生物碱提取组合为A1B2C3D4E3，即按料液比1∶20，以800W超声功率在60℃用60%乙醇提取20m in。

2.3 验证实验

取新疆药桑桑叶干粉三份，每份10g按优选出来的最佳工艺进行提取，即按料液比1∶20，以800W超声功率在60℃用60%乙醇提取20m in。按1.2.3的检测方法进行检测，按最佳工艺进行提取，总生物碱平均含量为4.64mg·g-1，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.73%，实验结果高于正交实验的其他组合，说明实验结果是稳定可行的。

表2 L16（45）正交实验及其结果Table2 Results of L16（45）orthogonal test

表3 正交实验结果方差分析Table3 Variance analysis of orthogonal test results

3 结论与讨论

目前桑叶中水溶性生物碱主要采用乙醇溶剂提取法、水或酸水提取法和亲脂性有机溶剂提取法等[9]。水或酸水提取法虽能够提取大部分的生物碱，但水溶性杂质过多，如果需要进一步分离纯化总生物碱，其水提液仍需加入乙醇沉淀除去桑叶多糖类物质的干扰[10]。亲脂性有机溶剂提取法仅能够提取亲脂性生物碱，并且能够带来亲脂性杂质。乙醇溶剂提取法是目前桑叶总生物碱提取的主要方法，但其工艺比较复杂，而超声波处理利用超声空化作用和微扰效应，能够有效地使植物细胞壁破裂，使细胞更容易释放内容物，并促进溶剂进入提取物细胞，加速成分进入溶剂，可大大缩短萃取时间和提高萃取率[11]，因此本实验采用超声波辅助的乙醇溶剂提取法提取桑叶总生物碱。

桑叶中总生物碱的含量测定方法主要有：重量沉淀法[12]、紫外分光光度法[13]、高效液相色谱法（HPLC）[14]和液相色谱-质谱联用法（LC-MS）[15]等。紫外分光光度法所需的蒸发光散射检测器、示差折光检测器等虽然灵敏度高结果较准确可靠，但其价格昂贵，不利于大面积应用普及[16]。何军等[17]比较了紫外分光光度法和重量沉淀法在测定附子总生物碱含量中的差异，发现重量沉淀法准确性、稳定性要优于紫外分光光度法。因此，本实验采用经典的重量沉淀法，具有不需要使用昂贵的对照品（如DNJ）、操作简单、快捷等优点。为排除非生物碱成分（多糖、多肽、蛋白质等）对本检测方法准确性的影响，将浓缩的样品液加入90%乙醇，结果未见多糖结晶析出。并且供试液在3h内稳定，重现性良好，可作为新疆药桑桑叶总生物碱含量测定的方法。

本实验采用正交实验优化新疆药桑桑叶总生物碱的最佳提取工艺，在最佳实验条件：提取时间20m in，提取温度60℃，料液比1∶20，超声功率800W，乙醇浓度60%，得到总生物碱含量为4.64mg·g-1。结果表明利用超声波辅助的乙醇溶剂提取法提取新疆药桑桑叶总生物碱具有省时、高效、节能的优点。

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