微波辅助提取番石榴多酚的研究

邝高波，黄 和

（广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088）

番石榴（Psidium guajava L.）属于桃金娘科番石榴属，为亚热带水果，在我国广东、广西、福建均有种植，味清香可口，果实中含有果肉86.5%，水分83.3%，各种营养成分每100g含有粗纤维3.8%～5.57%，粗蛋白0.76%～1.06%，粗脂肪0.36%～0.94%，除此之外，维生素和矿物质含量也十分丰富[1]。番石榴中还含有黄酮、多酚、多糖等功能活性物质，具有抗氧化、抗衰老、止泻等生理功能[2]，对心血管疾病等有预防作用。王琦等[3]对几种台湾水果的抗氧化能力和多酚含量进行了研究，发现番石榴中多酚含量和抗氧化活性均达到很高水平。Melo P S等[4]研究表明，番石榴中含有没食子酸、槲皮素、儿茶素等多酚物质。

植物多酚结构复杂，性质活泼，根据化学结构的不同分为水解单宁和缩合单宁，分子量一般在500～3000u范围内。植物多酚具有抗氧化、清除自由基、抗病毒、抗肿瘤、抑菌消炎等作用[5]，近年来在食品和医药行业得到广泛的应用。微波辅助提取是一种快速高效的提取生物活性物质的方法，微波穿透力极强，可以渗透到基质内部引起极性物质定向排列，产生高温和高细胞内压使得细胞内物质裂解释放。它适合多种天然物质的提取，和其他方法相比，主要优点在于提取速度快、选择性提取强、能耗低，设备简单[6-7]。番石榴中多酚物质的提取已有过些许研究[8-9]，但是将微波辅助提取技术用于番石榴果肉中多酚物质的提取还未见报道。本实验对番石榴多酚的微波辅助提取工艺进行探讨，以微波功率、提取时间、乙醇体积分数、料液比和提取次数进行单因素实验，然后选取微波功率、提取时间和料液比三个因素对工艺进行响应面优化，为番石榴多酚的综合利用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

番石榴 购于湛江沃尔玛超市，产地湛江；没食子酸对照品、钼酸钠、钨酸钠、硫酸锂、无水碳酸钠、无水乙醇、溴水、磷酸、盐酸 均为国产分析纯；果胶酶（≥30000U/g） 上海基免生物科技有限公司。

BL-620S电子天平、AUY-120电子分析天平日本Shimadzu公司；722S可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；SIGMA3-18K高速冷冻离心机 北京博励行仪器有限公司；HR2006搅拌机 珠海经济特区飞利浦家庭电器有限公司；EG720EAU-SS9（X）微波炉 佛山市顺德区美的微波电器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 微波辅助提取番石榴多酚 将新鲜的番石榴清洗后打浆，称取适量于烧杯中，加入乙醇溶液，搅拌后置于微波炉中加热，然后用纱布过滤收集提取液，提取液中加入适量果胶酶进行酶解（37℃），冷冻离心后（8000r/m in，5m in）收集上清液。

1.2.2 Folin-ciocalteu法测定番石榴多酚含量

1.2.2.1 标准曲线的绘制 参照郑仕宏[10]的方法对番石榴多酚含量测定的条件进行了改良。称量50g钨酸钠，12.5g钼酸钠于1L回流装置中，加入350m L蒸馏水以及85%的磷酸25m L、浓盐酸50m L，充分混匀后小火回流10h。再加入75g硫酸锂，25m L蒸馏水及几滴溴水，加热至沸腾15m in，配制成福林酚试剂。降温后定容至500m L，保存在冰箱中备用，使用时稀释一倍。

准确称取0.05g没食子酸，定容至1000m L，配制成50μg/m L的没食子酸标准液。常温下分别移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4m L没食子酸标准溶液到10m L比色管，加入福林酚试剂2m L，摇匀后再加入质量分数为12%的碳酸钠溶液2.5m L，反应30s后用蒸馏水定容至10m L，放置黑暗处反应2h，765nm下测定吸光度，以没加没食子酸标准液的反应液为空白对照，制作标准曲线。

1.2.2.2 多酚提取得率的计算 计算公式如下所示：

式中，C—样品多酚浓度；V—多酚溶液的体积；m—番石榴浆质量。

1.2.3 单因素实验设计

1.2.3.1 乙醇体积分数对番石榴多酚提取得率的影响 称取番石榴浆5g，在微波功率490W，料液比1∶10的条件下，分别用30%、40%、50%、60%、70%体积分数的乙醇提取70s，平行实验3次，测定总酚含量。

1.2.3.2 微波功率对番石榴多酚提取得率的影响 称取5g番石榴浆，在乙醇体积分数50%，料液比1∶10的条件下，分别在70、210、350、490、630W的功率下提取70s，平行实验3次，测定总酚含量。

1.2.3.3 提取时间对番石榴多酚提取得率的影响 称取5g番石榴浆，在乙醇体积分数50%，料液比1∶10，微波功率490W的条件下，分别提取10、40、70、100、130、160、190s，平行实验3次，测定总酚含量。

1.2.3.4 料液比对番石榴多酚提取得率的影响 称取5g番石榴浆，在乙醇体积分数50%，微波功率490W的条件下，分别以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25的料液比提取70s，平行实验3次，测定总酚含量。

1.2.4 响应面实验设计 综合单因素实验结果，选取微波功率、料液比和乙醇体积分数作为实验因素，以番石榴多酚提取得率为响应值，采用JMP软件进行响应面实验设计和分析，优化提取工艺，响应面的因素及水平见表1。

表1 因素水平编码表Table1 Independent variables and test design

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制作

按1.2.2.1的方法制作没食子酸标准曲线，如图1所示。得到的回归方程为y=0.1331x+0.0149，R2=0.9993，在1～7μg/m L浓度范围内具有良好的线性关系，适用于番石榴多酚总含量的测定。

图1 没食子酸标准曲线图Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 乙醇体积分数对番石榴多酚提取得率的影响

由图2可知，随着乙醇体积分数的增加，番石榴多酚的得率呈现先增大后降低的趋势，在乙醇体积分数为50%时番石榴多酚得率最大，达到了1.56mg/g。根据相似相溶原理，这时番石榴多酚的极性可能与乙醇溶液的极性相当，多酚类物质易于从组织中释放，因此确定乙醇体积分数为50%。

图2 乙醇体积分数对番石榴多酚提取得率的影响Fig.2 Effectof ethanol concentration on extraction rate

2.3 微波功率对番石榴多酚提取得率的影响

图3 微波功率对番石榴多酚提得取率的影响Fig.3 Effectofmicroware power on extraction rate

由图3可知，在一定范围内，番石榴多酚提取得率随着功率的升高而增加，在490W时达到1.74mg/g，超过490W后提取得率呈下降趋势。功率过低，微波的穿透力不强，物料温度偏低，分子运动过慢，影响多酚物质的提取。功率过高，可能导致多酚物质被高温破坏，得率较低，因此确定提取的微波功率为490W。

2.4 提取时间对番石榴多酚提取得率的影响

由图4可知番石榴多酚提取得率随提取时间的增加呈现先增加后下降的趋势，在130s时提取得率达到最大值，为1.71mg/g。随着时间的增加，溶液温度升高，提取率增大，但过高的温度会造成乙醇蒸发过快，多酚结构遭到破坏，导致得率下降，因此确定提取时间在130s。

图4 提取时间对番石榴多酚提取得率的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate

2.5 料液比对番石榴多酚提取得率的影响

由图5可知，在一定范围内，随着溶剂体积与质量比值的增加，溶质与溶剂接触的表面积增大，番石榴多酚提取率逐渐增大，但是当料液比低于1∶20后，提取得率变化不大，此时多酚物质已基本完全浸出，再增加溶剂和物料的比例会造成原料的浪费，因此确定料液比为1∶20为宜。

图5 料液比对番石榴多酚提取得率的影响Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate

2.6 响应面优化提取工艺

2.6.1 响应面实验结果 在单因素实验基础上，采用JMP9软件中Box-Behnken模型，选取微波功率（X1）、料液比（X2）和乙醇体积分数（X3）进行三因素三水平的响应面设计，以番石榴多酚提取率为响应值（Y），结果见表2。

2.6.2 响应面模型分析 采用JMP9软件对数据进行模型拟合分析，得到二次多项式方程：Y=1.8233333-0.0125X1+0.04X2+0.0075X3+0.0175X1X2+0.0425X1X3-0.0225X2X3-0.067917X-0.087917X-0.062917X，对回归方程进行显著性检验和方差分析，结果见表3。由表3可知，模型p值为0.0003＜0.01，达到极显著水平，相关系数为R2=0.9883，R=0.9672，线性关系良好，表明实验设计合理可行。失拟项p值为0.656＞0.05为不显著，失拟性良好，表明在实验条件下该方程模型可以预测番石榴多酚的提取得率。

表2 响应面方案与实验结果Table2 Design and results of central composition test

表3 方差分析表Table3 Table of variance analysis

根据F值大小可以得到各变量对番石榴多酚提取率的影响顺序为：料液比（X2）＞微波功率（X1）＞乙醇体积分数（X3）。其中料液比对多酚提取率影响极显著（p=0.0004），微波功率对多酚提取率的影响为显著水平（p=0.0476），乙醇体积分数对多酚提取率影响不显著。二项式X、X、X的p值都达到极显著水平，X1X2项p值为0.0491，表明料液比和微波功率的交互作用对番石榴多酚的提取影响显著。X2X3项的p值为0.0209，表明料液比和乙醇体积分数的交互作用对番石榴多酚的提取也是有显著影响，X1X3项p值为0.0015，表明微波功率和乙醇体积分数交互作用对番石榴多酚提取影响达到极显著水平。

2.6.3 响应面图分析 响应面图可以直观的看出因素之间的交互作用对多酚提取率的影响，将某个单因素固定在零水平，即可得到其他两个因素的响应面图（见图6～图8）。

图6显示了在乙醇体积分数50%、时间为130s时，微波功率和料液比之间的交互作用对番石榴多酚提取得率影响的响应面图。从图中可知，当微波功率一定时，多酚提取得率随着料液比（m∶v）的降低而增加。当料液比一定时，提取得率随着功率增加先增大后降低，但是变化较不明显。微波功率和料液比之间的交互作用图存在顶点，等高线呈椭圆形，在微波功率490～560W，料液比1∶19～1∶23范围内响应值较大，对多酚提取得率影响显著。

图6 微波功率和料液比对番石榴多酚提取得率的响应面图Fig.6 Response surface showing the interactive effects of microware power and solid-liquid ratio on the polyphenols yield of guava

图7 微波功率和乙醇体积分数对番石榴多酚提取得率的响应面图Fig.7 Response surface showing the interactive effects of microware power and ethanol concentration on the polyphenols yield of guava

图7是在料液比1∶20、提取时间130s条件下，乙醇体积分数和微波功率交互作用图。由图7可知，在乙醇体积分数一定时，番石榴多酚提取得率随微波功率的增加而缓慢增大，在超过560W后，多酚提取得率快速下降。微波功率一定时，多酚提取得率随着乙醇体积分数的增加呈现先增大后减小的趋势，响应值在功率420～560W，乙醇体积分数45%～55%范围内最大，交互作用极显著。

图8描述了在微波功率490W、提取时间130s条件下，乙醇体积分数和料液比之间对番石榴多酚提取得率的交互作用。多酚提取得率在料液比达到1∶19之前增加趋势明显，然后缓慢升高。在乙醇浓度40%～50%范围内，多酚提取得率随着乙醇浓度的升高而增加，当乙醇浓度超过50%以后多酚提取得率缓慢下降。等高线为椭圆形，交互作用显著，在乙醇浓度50%～55%，料液比1∶21～1∶23范围内响应值最大。

图8 料液比和乙醇体积分数对番石榴多酚提取得率的响应面图Fig.8 Response surface showing the interactive effects of solid-liquid ratio and ethanol concentration on the polyphenols yield of guava

2.6.4 最佳工艺和验证实验 由JMP9软件分析得到微波辅助提取番石榴多酚的最佳工艺为微波功率483.21W，料液比1∶21.12（m∶v），乙醇浓度49.98%，提取时间130s，在此条件下番石榴多酚理论提取率可达到1.83mg/g。由于实际条件限制，适当调整为微波功率490W，料液比1∶21，乙醇浓度50%，提取时间130s。此时的理论提取率为1.82mg/g，经过验证实验，实际提取率为（1.78±0.38）mg/g，相对误差为2.19%，说明该模型能准确的应用于番石榴多酚的微波辅助提取工艺。

3 结论

微波辅助提取能有效的提取番石榴多酚，具有时间短、耗能少、效率高等优点。本实验探索的最佳的提取工艺为功率490W，料液比1∶21，乙醇浓度50%，提取时间130s，提取率为（1.78±0.38）mg/g，此工艺条件可以为番石榴多酚的进一步研究和综合利用提供技术参考。

[1]刘建林，夏明忠，袁颖.番石榴的综合利用现状及发展前景[J].中国林副特产，2005（6）：60-62.

[2]温靖，徐玉娟，肖更生，等.番石榴果实的营养价值和药理作用及其加工利用[J].农产品加工，2009（6）：11-13.

[3]王琦，余亚白，陈源，等.几种台湾水果的抗氧化能力研究[J].福建农业学报，2010，25（6）：703-706.

[4]Melo P S，Bergamaschi K B，Tiveron A P，et al.Phenolic composition and antioxidant activity of agroindustrial residues[J].Ciencia Rural，2011，41（6）：1088-1093.

[5]韩丙军，彭黎旭.植物多酚提取技术及其开发应用现状[J].华南热带农业大学学报，2005，11（1）：21-25.

[6]王明芝，于丽梅，高春梅，等.微波萃取技术在中药及天然产物提取中的应用[J].人参研究，2009（2）：29-32.

[7]郭景强.微波辅助提取技术及其在中药提取中的应用[J].天津药学，2010，22（4）：63-65.

[8]曹增梅，黄和.超声波辅助提取番石榴中多酚类物质的研究[J].食品与机械，2012，28（5）：123-126.

[9]张云竹，王芳，谭秀霞.番石榴中多酚物质的提取[J].食品研究与开发，2007，128（4）：40-44.

[10]郑仕宏，张海德，何双，等.Folin-Ciocalteus法测定槟榔中多酚含量的研究[J].中南林业科技大学学报，2009，29（6）：165-169.