响应面法优化葡萄籽多酚提取工艺

卢晓霆，王田田，*，王 军

（1.长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春130012；2.通化葡萄酒股份有限公司，吉林通化134002）

葡多酚抗氧化清除自由基能力强，在医药、保健品、食品和化妆品领域都具有广阔的应用前景[1-2]。不同品种的葡萄皮、籽中多酚物质的含量及其对ABTS和DPPH自由基的影响不同，多酚含量较高的葡萄皮为刺葡萄和桑叶葡萄，含量分别为47.1mg/g和31.2mg/g，多酚含量最高的葡萄籽为赤霞珠，多酚含量为103.6mg/g[3]。发酵后的皮籽中仍含有2%左右的多酚物质。葡萄皮籽大部分作为肥料、饲料或烧材，利用率很低。因此研究和解决葡萄皮籽利用问题，不仅有利于防止环境污染，而且可生产出高附加值的保健食品，具有一定的经济效益和社会效益。

总多酚的测定常用的方法有高锰酸钾滴定法、香草醛法、Folin-酚法（包括Folin-Denis法和Folin-Ciocalteau法）和铁氰化钾分光光度法（PB法）。紫外分光光度法因其干扰性物质较多，适用于原花青素含量纯度特别高的产品，不适合一般原料中原花青素的检测。香草醛法测定的是原花青素单体及其多聚体的总量。葡萄籽中总多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteau（FC）法和酒石酸铁比色法，测定结果有所不同[4]，本文比较了两种总多酚的测定方法对葡萄籽多酚提取量测定的影响，选用了其中一种用来测定多酚含量。

葡萄皮所含多酚物质与葡萄籽有所不同，葡萄皮中有水溶性色素花色苷，而籽中没有，对不同物质提取方法应有所不同[5-6]。通过对比实验采用超声辅助浸提葡萄籽多酚，并应用响应面法优化葡萄籽多酚提取工艺[7-10]，考察工艺参数对多酚提取量的影响，确定最佳工艺参数，为葡多酚功能活性深入研究创造一定条件，为进一步开发利用酿酒葡萄皮籽资源提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酿酒葡萄籽 由通化葡萄酒股份有限公司提供，直接收集的酿酒后下脚料山葡萄籽，自然阴干后冷藏，含水量在9%左右，采用普通粉碎，颗粒直径在0.5～1mm[6]；95%乙醇、没食子酸、抗坏血酸、硫酸亚铁、酒石酸钾钠、钨酸钠、钼酸钠、磷酸、硫酸锂、无水碳酸钠 均为国产分析纯。

101-1AB型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；JYL-D051型粉碎机 九阳股份有限公司；UV754型可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司；GL-21LM型高速冷冻离心机 湖南星科科学仪器有限公司；KQ-50TDB型高频数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 葡萄籽多酚物质测定方法的选择 采用酒石酸铁比色法[4-6]准确吸取1m L试液，转移至25m L容量瓶中，加蒸馏水4m L和酒石酸亚铁溶液5m L，充分混合，再加pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液至刻度，用10mm比色皿，在波长540nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度A[11]。

FC法测定[12]，准确吸取1m L试液，转移至100m L容量瓶中，加水60m L，FC显色剂5m L，混匀，30s～8m in内各加入20%碳酸钠溶液15m L，混合后用水定容，在20℃下放置2h然后用紫外-可见分光光度计测定在765nm下的吸光值A。

FC显色剂：称取钨酸钠（Na2WO4·2H2O）（50± 0.01）g，钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）（12.5±0.01）g，用水350m L溶于1000m L回流瓶中，加入磷酸（H3PO4≥85%）25m L及50m L浓盐酸，充分混匀，小火加热回流2h，再加入硫酸锂75g，蒸馏水25m L及数滴溴水；然后开口继续沸腾15m in，使得溴水完全挥发为止；冷却后定容500m L，过滤，置于棕色瓶中，用时加入1倍蒸馏水。

式中：W为多酚提取量，mg/g；C为待测液中多酚的浓度，mg/m L；V为待测液体积，m L；N为稀释倍数；M为样品质量，g。

1.2.2 标准曲线的绘制 酒石酸铁比色法标准曲线的建立[11]：准确称取没食子酸0.500g，加蒸馏水溶解并定容至100m L容量瓶中，得到5000mg/L的没食子酸标准溶液。在7只100m L容量瓶中分别加入没食子酸标准溶液0、1、2、3、4、5、10m L，加蒸馏水定容至100m L，分别配制成浓度为0、50、100、150、200、250、500mg/L的试液。各吸取1m L试液于25m L容量瓶中，步骤同上，绘制标准曲线。

Folin-Ciocalteau法标准曲线的建立[12]：称取0.500g没食子酸，用水溶解，定容至100m L，以此母液配制质量浓度为0、50、100、150、250、500mg/L的系列标准溶液。分别吸取系列标准溶液1m L于100m L容量瓶，步骤同上，绘制标准曲线。

1.2.3 提取方法及提取溶剂的选择实验 称取葡萄籽粉碎物4份各1g，放入试管中，编号a、b、c、d。a双水相水浴：95%乙醇6m L，水4m L，硫酸铵1g，40℃水浴2h。b双水相超声：95%乙醇6m L，水4m L，硫酸铵1g，40℃，35W超声2h。c乙醇水浴：95%乙醇10m L，40℃水浴2h。d辅助超声：95%乙醇10m L，40℃，35W超声2h。离心，各取上清液1m L测吸光度，平行测定三次，计算多酚提取量。

称取葡萄籽粉碎物6份各1g，准确至0.0001g，分别加入10m L蒸馏水、体积分数95%乙醇、体积分数80%乙醇、体积分数70%乙醇、体积分数60%乙醇、体积分数50%乙醇中。40℃，35W超声2h。离心，各取上清液1m L测吸光度，平行测定三次，计算多酚含量。

1.2.4 粗脂肪脱除对多酚提取量的影响 通过索氏提取法利用石油醚去除粗脂肪，然后置阴凉通风处挥尽样品中的石油醚，称取脱脂后的葡萄籽粉末1g，加入95%乙醇10m L，40℃，35W超声2h。离心，取上清液1m L测吸光度。与未脱脂葡萄籽进行比较。

1.2.5 葡萄籽总多酚提取的单因素实验

1.2.5.1 液料比对葡萄籽多酚提取量的影响 称取葡萄籽粉6份各1g，分别加入6、8、10、12、14、16m L体积分数为95%乙醇溶液，在超声功率为25W，浸提温度40℃条件下超声40min，测定吸光值，计算多酚提取量。

1.2.5.2 超声时间对葡萄籽多酚提取量的影响 称取葡萄籽粉6份各1g，分别加入12m L体积分数为95%乙醇溶液，浸提温度40℃，超声功率25W条件下超声20、40、60、80、100、120m in，测定吸光值，计算多酚提取量。

1.2.5.3 超声功率对葡萄籽多酚提取量的影响 称取葡萄籽粉5份各1g，加入12m L体积分数为95%的乙醇溶液，浸提温度40℃，分别在超声功率20、25、30、35、40W条件下超声40m in，测定吸光值，计算多酚提取量。

1.2.5.4 浸提温度对葡萄籽多酚提取量的影响 称取葡萄籽粉5份各1g，加入12m L体积分数为95%的乙醇溶液，超声功率25W，分别在浸提温度35、40、45、50、55℃条件下超声40m in，测定吸光值，计算多酚提取量。

1.2.6 响应面优化实验 在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken设计的自变量，以多酚提取量为响应值，进行提取条件的优化。响应面分析因素和水平表见表1。

表1 响应面分析因素和水平表Table1 The table of factors and levels used in response surface analysis

2 结果与分析

2.1 标准曲线

酒石酸铁比色法标准曲线回归方程y=0.0127x，R2=0.9996。Folin-Ciocalteau法标准曲线回归方程y= 0.1175x+0.0088，R2=0.9999。

图1 酒石酸铁法标准曲线Fig.1 The stand curve of ferrous tartrate

图2 FC法标准曲线Fig.2 The stand curve of FCmethod

2.2 提取方法与测定方法的选择实验结果

结果表明对于同一种样品，所选用的测定方法不同，多酚所得含量结果也有所不同，葡萄籽多酚中含量较多的是黄酮醇类化合物、儿茶酸类和酚酸类化合物。FC法测定时，FC试剂与样品中易氧化的羟基作用，生成蓝色物质，这样一部分酚酸类物质不易检测出，而酒石酸铁可以与大量多酚物质反应生成紫红色物质，所测结果值大于FC法。对葡萄籽总多酚含量的测定本实验采用酒石酸铁法。同时可以看出，采用超声辅助提取所得多酚量较大，这可能是因为葡萄籽多酚为弱极性物质易溶于乙醇溶液，超声更有利于多酚物质的溶出，所以采用超声辅助提取葡萄籽多酚。

2.3 提取溶剂及粗脂肪脱除的选择结果

从试剂安全性及成本考虑，本实验选取蒸馏水和乙醇两种试剂进行比较。由图3可以看出，随着乙醇浓度的减小，多酚提取量逐渐降低，葡多酚具有弱极性，易溶于极性较低的乙醇溶液。因此实验采用体积分数为95%乙醇溶液作为提取液来提取葡萄籽多酚。

进行脱脂实验结果表明，未经脱脂处理的葡萄籽多酚提取量为11.55mg/g，脱脂后葡多酚提取量约为4.37mg/g，比未进行脱脂的葡萄籽多酚提取量减少约6～7mg。可能是由于脱脂过程中部分多酚物质溶于石油醚，随石油醚挥发，进而提取量下降，因此，建议提取之前不进行脱脂处理。

图3 提取剂对多酚提取量的影响Fig.3 Effectof extraction solvents on the yield of polyphenols

2.4 葡萄籽总多酚提取的单因素实验结果

2.4.1 液料比对葡萄籽多酚提取量的影响 由图4可以看出，多酚提取量随着液料比的增大而增大，但当液料比大于12∶1后，随着乙醇量的增大多酚含量略有增加，但幅度小。可能是由于随着溶剂的量增加，多酚物质在较短时间内与大量溶剂接触，溶解度相应增大，但达到一定程度后多酚几乎溶解完全，继续增加溶剂增幅较小，考虑成本，取液料比10∶1、12∶1、14∶1作为较优水平。

图4 液料比对多酚提取量的影响Fig.4 Effectof liquid-to-solid ratio on the yield of polyphenols

表2 不同浸提方式、测定方法对多酚提取量的影响Table2 Effect of extraction and measurementmethod on the yield of polyphenols

2.4.2 超声时间对葡萄籽多酚提取量的影响 由图5可以看出，多酚的提取量随着超声时间的延长逐渐增大，但120m in左右时略有下降。可能是由于多酚物质随着时间的延长慢慢浸出，但达到一定时间后浸出完全，再随时间延长多酚物质被氧化并且杂质溶出，所以所测提取量减小。综合考虑，超声时间选60、90、120m in作为较优水平。

图5 超声时间对多酚提取量的影响Fig.5 Effect of extraction time on the yield of polyphenols

2.4.3 超声功率对葡萄籽多酚提取量的影响 由图6可以看出，葡萄籽多酚提取量随超声功率的增加呈先上升后下降的趋势。当超声功率为30W时，提取量最大。这可能是因为，随着超声的增大，机械剪切力使多酚逐渐溶出，但超声功率过大，引起多酚结构发生变化，从而提取量逐渐降低[13]。选择超声功率30、35、40W。

图6 超声功率对多酚提取量的影响Fig.6 Effectof ultrasonic power on the yield of polyphenols

图7 浸提温度对多酚提取量的影响Fig.7 Effectofextraction temperature on the yield ofpolyphenols

2.4.4 浸提温度对葡萄籽多酚提取量的影响 由图7可以看出，葡萄籽多酚提取量随浸提温度的升高呈先上升后下降的趋势，当温度达到50℃时提取量最大。可能是由于温度升高有利于多酚物质的运动，在不断震动下溶出，当温度上升到一定后，多酚物质易被氧化变构，从而影响检出量。因此，提取温度选择45、50、55℃。

2.5 葡萄籽多酚提取工艺条件优化

2.5.1 响应面实验结果 采用Design-Expert 7.0软件，根据Box-Behnken设计组合，以多酚提取量为响应值，进行提取条件的优化。实验设计方案及数据结果见表3，对表3中数据进行方差分析，结果见表4。

表3 Box-Behnken设计方案及响应值结果Table3 Box-Behnken experimental design and corresponding results

由表4分析得出，该二次回归方程的模型项、单项D、二次项A2、B2、C2、交互项AD、BC、BD表现出差异极显著，AC表现出差异显著。表明该模型差异显著。对表3结果进行统计分析可得二次回归方程如下：

回归方程的相关系数R2=0.8981，说明该方程与实际情况拟合良好，可以用该方程代替真实实验进行分析。由表4中p值可知，在各因素所选的范围内，对多酚提取量影响的大小依次为D（浸提温度）＞C（超声功率）＞A（液料比）＞B（时间）。二次多项式的方差分析显示该模型的p值小于0.01，显著，失拟项p= 0.2613，不显著。说明该模型拟合结果好[14]。综上所述，建立的回归方程能代替实验真实点来解释相应结果。

表4 响应面二次模型方差分析Table4 Analysis of variance of the original quadratic regressionmodel

2.5.2 葡萄籽多酚提取量的响应面分析 由图8可以看出，时间和超声功率，时间和浸提温度，液料比和浸提温度的交互作用图中均存在极点，说明交互作用显著，与二次模型方差分析结果一致。图8（a）显示，在一定范围内，温度和液料比一定的情况下，浸提时间在100m in左右，超声功率为35W左右时，多酚提取量较高。可以看出，随着时间的延长提取量逐渐增大，但超过100m in后，提取量迅速减小，可能是长时间的超声破坏了多酚结构并且随着时间的延长部分多酚氧化，从而影响了提取量。由图8（b）显示，当液料比和超声功率一定时，多酚提取量随温度的升高变化缓慢，但随时间的延长提取量增长较快，大约在45℃时较高。由图8（c）可以看出，在超声功率与时间一定的情况下，多酚提取量随浸提温度和液料比的不同变化显著，浸提温度达到45℃左右，液料比为13∶1左右时，提取量较高。由图8（d）显示，在浸提温度和时间一定的情况下，提取量随着超声功率和液料比的增大先增大后减小。

图8 各因素交互作用对多酚提取量的响应面图Fig.8 Response surface showing the pairwise interactive of four operating parameters on the extraction yield of polyphenols

2.5.3 最佳工艺条件的预测和检验 结合响应面分析方差分析结果得到最佳提取工艺参数为，液料比13.09∶1，浸提时间100.64m in，超声功率36.49W，浸提温度45.03℃。在此条件下，葡萄籽多酚的提取量为17.47mg/g，提取率约达87.4%（酿酒后的葡萄籽中多酚含量大约占2%左右，1g葡萄籽中则大约含20mg多酚）。为方便实际操作，将工艺参数修订为液料比13∶1，浸提时间100min，超声功率36W，浸提温度45℃。实际测得多酚提取量为17.22mg/g，与预测值基本吻合。此条件下，进行第二次浸提，得多酚2.03mg/g，提取量较少，考虑试剂成本，可以忽略，只浸提一次。

3 结论

本实验中，对葡萄籽总多酚的测定选用酒石酸铁法所得多酚含量较高，对多酚的测定具有一定的实验参考价值。采用超声波辅助提取葡萄籽多酚，通过单因素实验和响应面分析优化得到的提取多酚的最佳工艺条件为液料比13∶1，浸提时间100min，超声功率36W，浸提温度45℃。实际多酚提取量为17.22mg/g，说明该工艺合理，进行一次可以较充分提取，在实际应用过程中具有一定的实验参考价值。

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