高压二氧化碳对鲜榨梨汁杀菌效果及动力学研究

廖红梅，丁占生，钟 葵，龙飞翊，廖小军

（1.江南大学食品学院，江苏无锡214122；2.中国农业科学院农产品加工研究所，北京100193；3.浏阳市质量监督检验及计量检定所，湖南浏阳410300；4.国家果蔬加工工程技术研究中心，北京100083）

鲜榨梨汁具有清新的天然风味和较高营养价值，含有多种人体必需氨基酸、维生素及丰富的矿物质。梨汁可以清热解毒、平喘止咳，深受人们欢迎[1]。但鲜榨梨汁中含有许多微生物，易引起腐败变质，需要通过杀菌处理以达到保质目的。

高压二氧化碳（High pressure carbon dioxide，HPCD）技术是一项具有极大潜力的新型杀菌技术。前期大量研究将HPCD应用到成分单一的液态媒介中，例如各种培养基、缓冲液和生理盐水。随着研究深入，逐渐将其应用到成分复杂的食品体系，主要是各种果蔬汁、牛奶和啤酒等。例如，Parton等[2]采用多批间歇式HPCD处理系统（multi-batch apparatus）对梨汁中酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）进行杀菌，在9MPa，32℃或38℃下处理24m in酿酒酵母降低了6.53个对数。Liao等[3]采用间歇式HPCD处理系统对苹果浊汁中大肠杆菌（Escherichia coli）进行杀菌，在30MPa，42℃下处理75m in能使其中大肠杆菌降低7.6个对数，达到完全灭菌。但这些研究主要是针对在各种液态体系中接入单一种类微生物，仅有少量研究涉及到食品体系中的自然微生物群[4]。已有研究包括对橙汁[5-6]、葡萄汁[4，7]、苹果汁[8]和荔枝汁[9]中细菌菌落总数、霉菌和酵母总数的杀菌效果研究。目前还没有采用HPCD对鲜榨梨汁中自然微生物进行杀菌处理的研究。

本文以鲜榨梨汁为原料，研究HPCD技术对梨汁中细菌菌落总数的影响，并采用Weibull分析HPCD杀菌动力学过程，旨在为HPCD在鲜榨梨汁中的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸭梨 市售新鲜鸭梨；营养琼脂培养基 北京奥博星科技有限公司。

高压二氧化碳装置 江苏华安科研仪器有限公司；ZDX-35BI型座式自动电热压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；DHP-9082型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1FD型无菌操作台 苏州尚田洁净技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鸭梨汁的制取 市售新鲜鸭梨，清水清洗表皮、切成1cm3小块，立即用0.3%抗坏血酸护色液浸泡并榨汁，随后采用四层纱布（相当于200目绢布）过滤。取得梨汁混匀后于4℃冷藏备用，冷藏时间不超过8h。

1.2.2 高压二氧化碳处理鸭梨汁 取出在4℃冷藏的鲜榨梨汁（初始细菌菌落总数为102～103CFU/m L），在无菌操作台中无菌操作量取25m L梨汁于已灭菌的50m L塑料离心管中，每个处理准备3个离心管，共75m L。立即将分装好的样品置于已经预热好的高压二氧化碳处理釜中。密闭处理釜后进行升压，达到设定压强后进行保温、保压处理一定时间，缓慢卸压并将装有梨汁的离心管取出，放置无菌瓶中在冰箱中冷却，以备测定梨汁中细菌菌落总数。同时做热处理对照，即在不通入高压CO2的条件下，采用与HPCD处理一致的温度、时间、加样量条件处理鲜榨梨汁，并测定其中细菌菌落总数。

1.2.3 微生物数量测定 采用平板计数法测定微生物数目。将菌液用0.85%生理盐水以10倍稀释法进行逐级稀释，根据细菌数量选择合适的稀释度进行逐级稀释，吸取连续3个不同稀释度的稀释样1.0m L于灭菌平皿中，倒入约15m L营养琼脂培养基，摇匀后在（37±0.1）℃条件下培养24h。并记录菌数。

杀菌效果采用残活率对数值（LogN/N0）表示，其中：N0为HPCD处理前的初始微生物数量（CFU/m L）；N为HPCD处理后的微生物数量（CFU/m L）。

1.2.4 梨汁中微生物杀菌效果动力学模型分析 采用Weibull模型，该模型由Weibull等[10]于1951年提出：

式中：N0为HPCD处理前的初始微生物数量（CFU/m L）；N为HPCD处理后的微生物数量（CFU/m L）；a和b分别为比例因子和形状因子，t为处理时间。

1.2.5 数据统计分析 所有实验均重复三次，数据采用方差分析（ANOVA）。数据采用Origin 7.5进行统计并绘图。

2 结果与分析

2.1 HPCD处理中压强和温度对梨汁中细菌菌落总数活性的影响

图1 HPCD处理压强、温度对梨汁中细菌菌落总数活性影响Fig.1 Effectof pressure and temperature on inactivation of totalaerobic bacteria in pear juice as exposed to HPCD for 50min

图1表示HPCD处理中压强、温度对梨汁中细菌菌落总数活性的影响。

在相同压强和处理时间的条件下，随处理温度升高，梨汁中菌落总数残存率显著下降（p＜0.05），表明HPCD处理时温度具有协同杀菌效应：在20MPa下处理50m in，温度分别为20、30和40℃时，梨汁中细菌总数分别降低了0.85、1.11和1.53个对数；在25MPa下处理50min，温度分别为20、30和40℃时，梨汁中细菌总数分别降低了1.99、2.10和2.26个对数；在30MPa处理50m in，当温度分别为20、30和40℃时，梨汁中细菌总数分别降低了2.26、2.41和2.65个对数。目前关于处理温度能协同增强HPCD杀菌效果的解释，一方面是，较高的温度能促进CO2的溶解、利于其穿透细胞膜，从而提高HPCD对微生物的杀灭效果；另一方面是，处于临界点附近的温度改变能使亚临界状态CO2变为超临界状态，而超临界状态下CO2的溶解度和密度显著增强，因此临界点附近的温度能提高杀灭效果[11]。

由图1可知，随着处理压强升高，梨汁中菌落总数残存率显著下降（p＜0.05）。在30℃条件下处理50m in，当处理压强分别为20、25和30MPa时，梨汁中细菌菌落总数分别降低了1.11、2.10和2.41个对数。这与已有研究结果一致[12-13]。主要是由于较高的压强一方面能够提高CO2渗透性和溶解能力，增加CO2与微生物细胞内部物质的接触；另一方面也提高了对细胞的机械损伤，使微生物细胞壁和细胞膜破损而致死[14]。

2.2 HPCD处理时间对梨汁中菌落总数活性的影响

图2～图4，为不同温度、压强条件下随着处理时间延长，HPCD处理和热处理对梨汁中细菌菌落总数的杀菌曲线。在40℃条件下处理20min，热处理和HPCD（30MPa）处理分别使梨汁中细菌菌落总数降低了0.08和1.57个对数；当处理时间延长到60m in时，热处理和HPCD（30MPa）处理分别使梨汁中细菌菌落总数降低了0.18和2.66个对数。在相同温度和处理时间条件下，HPCD处理的杀菌效果显著高于热处理杀菌效果（p＜0.05），且随着处理时间延长，二者之间差距显著增大。说明在HPCD处理过程中，温度对其杀菌效果具有协同效应。

图220℃下HPCD对鲜榨梨汁中菌落总数活性影响Fig.2 Inactivation of total aerobic bacteria in pear juice as exposed to HPCD at20℃

图330℃下HPCD对鲜榨梨汁中菌落总数活性影响Fig.3 Inactivation of total aerobic bacteria in pear juice as exposed to HPCD at30℃

图440℃下HPCD对鲜榨梨汁中菌落总数活性影响Fig.4 Inactivation of total aerobic bacteria in pear juice as exposed to HPCD at40℃

压力和处理时间是影响HPCD杀菌效果的重要因素。研究表明，随压力的增大HPCD对细菌的钝化作用也随之增强，是因为压力可以控制CO2的溶解速率以及溶解度，增加压力可以使CO2溶解能力增强，利于HPCD萃取出细胞内生命物质，使微生物细胞破裂死亡[14]。同一温度下随处理压力和处理时间增加HPCD的杀菌效果显著增强（p＜0.05）。在20℃处理20m in，当压强由20MPa升高至25MPa、30MPa时，梨汁中菌落总数分别下降了0.37和0.79个对数。表明随压力增加，残存率显著下降（p＜0.05）。这种杀菌效果随着压强升高而增强的趋势在其他温度下也很明显。另一方面，当压力20MPa时，随处理时间增加菌落总数残存率下降缓慢，从20m in增加到60m in时残存率下降不到0.8个对数，表明杀菌效果较弱。在HPCD处理条件为30MPa、20℃、60m in时，鲜榨梨汁中自然菌落活菌率降低了2.36个对数（图2）。

不同温度下随着处理压力和时间的变化，HPCD的杀菌曲线呈现类似的变化趋势。此外，较高温度时，随着处理时间的进一步延长，梨汁中菌落总数的下降趋势减缓，表现为曲线逐渐变得较为平滑，如40℃、30MPa时，随处理时间从50m in延长至60m in，微生物残存率没有显著变化（p＞0.05）。其中，在HPCD处理条件为30MPa、40℃、60m in时，杀菌效果最好，使鲜榨梨汁中菌落总数的残存率下降了2.66个对数。

2.3 HPCD对梨汁中菌落总数活性影响的动力学分析

表1 Weibull模型分析鲜榨梨汁中菌落总数杀灭效果的动力学参数Table1 Estimations of the kinetic parameters and R2 of inactivation of total aerobic bacteria in pear juice using the Weibullmodel

微生物杀菌动力学模型分析是研究杀菌技术的理论关键之一。利用食品预测微生物学方法和理论，通过研究加工因素、微生物因素和产品因素对HPCD杀菌过程的影响，建立预测模型和回归方程，能更好地理解HPCD杀菌动力学及机理，提高其杀菌效果，确保食品安全[15]。果汁饮料中菌落总数变化的动力学分析和相关数学模型建立，对非热加工技术实际应用具有较好的理论指导意义。在HPCD杀菌研究中，很多学者采用了一级动力学模型来分析杀菌过程。

根据图2～图4的杀菌曲线，本文采用Weibull模型分析和拟合HPCD对梨汁中菌落总数杀菌动力学过程。Weibull模型描述ln（N/N0）和处理时间t之间的相关性，以ln（N/N0）为y轴，处理时间t为x轴作图，采用Origin 7.5进行数据的模型拟合并得到相关参数a和b。通常认为a因子是速度常数，b因子代表失活曲线的形状。b＜1时失活曲线时凹面；b＞1时是凸面；b=1时是一条直线，即一级动力学反应[16]。结果表明（表1），Weibull模型能够很好地拟合HPCD对菌落总数杀灭效果的动力学变化，相关系数均在0.9725以上，模型值和实验值之间数值之间差异不显著，表明能较好反映HPCD处理下菌落总数的失活曲线变化。随压力和处理温度升高，比例因子a逐渐降低，表明随温度升高，压力增大，菌落总数失活效果更加明显；b值也呈现变小趋势，表明失活曲线的凹面更加明显，失活动力学不是简单的一级动力学。

图5 HPCD对梨汁中菌落总数杀菌效果Weibull模型预测值和实测值的比较图Fig.5 Correlation between the experimental data and the predicted data obtained with themodel

图5为杀菌效果的实验值和Weibull模型值比较图。由图5可见，Weibull模型预测值和实测值的数值之间差异很小，相关系数R2都大于0.97，表明Weibull模型拟合度很高，能较好的反映HPCD处理下菌落总数的失活曲线变化。

3 结论

随着处理温度升高，梨汁中细菌菌落总数显著降低（p＜0.05）；在相同温度和处理时间条件下，HPCD处理的杀菌效果显著高于热处理杀菌效果，处理温度对HPCD杀菌效果具有协同效应；随着压强升高、处理时间延长，HPCD对梨汁中细菌菌落总数的杀菌效果显著增强（p＜0.05）；当HPCD处理条件为30MPa、40℃、60m in时，灭菌效果最佳，梨汁中细菌菌落总数的残存率降低了2.66个对数。

Weibull模型能较好地拟合HPCD处理后梨汁中细菌菌落总数的失活曲线，随压力增加和温度升高，模型动力学参数比例因子a和形状因子b呈现逐渐变小的规律性变化。

[1]胡长海，丁元凯.梨汁的酶法保鲜[J].辽宁工学院学报，1997，17（4）：85.

[2]Parton T，Elvassore N，Bertucco A，et al.High pressure CO2inactivation of food：Amulti-batch reactor system for inactivation kinetic determination[J].Journalof Supercritical Fluids，2007，40：490-496.

[3]Liao H M，Zhang Y，Hu X S，et al.Behavior of inactivation kinetics of Escherichia coli by dense phase carbon dioxide[J].International Journal of Food Microbiology，2008，126：93-97.

[4]Parton T，Bertucco A，Bertoloni G.Pasteurisation of grape must and tomato paste by dense-phase CO2[J].Italian Journal of Food Science，2007，19（4）：425-437.

[5]Arreola AG，Balaban M O，WeiCI，etal.Effectof supercritical carbon dioxide onmicrobial populations in single strength orange juice[J].Journal of Food Quality，1991，14（4）：275-284.

[6]Yagiz Y，Lim S L，Balaban M O.Continuous high pressure CO2processing ofmandarin juice[C].IFTAnnual Meeting Book of Abstracts，2005-07.

[7]Del Pozo-Insfran D，Balaban M O，Talcott S T.Microbial stability，phytochemical retention，and organoleptic attributes of dense phase CO2processed muscadine grape juice[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（15）：5468-5473.

[8]Liao H M，Zhang L Y，Hu X S，et al.Effect of high pressure CO2and mild heat processing on natural microorganisms in apple juice[J].International Journal of Food Microbiology，2010，137（1）：81-87.

[9]Li H，Zhao L，Wu J H，et al.Inactivation of natural microorganisms in litchi juice by high-pressure carbon dioxide combined with mild heat and nisin[J].Food Microbiology，2012，30（1）：139-145.

[10]Weibull W A.Statistical distribution function of wide applicability[J].Journal of Applied Mechanics，1951，51：293-297.

[11]Garcia-Gonzalez L，Geeraerd A H，Spilimbergo S，et al.High pressure carbon dioxide inactivation of microorganisms in foods：The past，the presentand the future[J].International Journal of Food Microbiology，2007，117（1）：1-28.

[12]Ferrentino G，Balaban M O，Ferrari G，et al.Food treatment with high pressure carbon dioxide：Saccharomyces cerevisiae inactivation kinetics expressed as a function of CO2solubility[J].Journal of Supercritical Fluids，2010，52（1）：151-160.

[13]Bae Y Y，Lee H J，Kim S A，et al.Inactivation of Alicyclobacillus acidoterrestris spores in apple juice by supercritical carbon dioxide[J].International Journal of Food Microbiology，2009，136（1）：95-100.

[14]Damar S，Balaban M O.Review of dense phase CO2technology：microbial and enzyme inactivation，and effects on food quality[J].Journal of Food Science，2006，71（1）：R1-R11.

[15]廖红梅，成玉梁，廖小军，等.预测微生物学在高压二氧化碳杀菌动力学的应用进展[J].食品工业科技，2012，33（13）：366-372.

[16]Rodrigo D，Ruíz P，Barbosa-Cánovas G V，et al.Kinetic model for the inactivation of Lactobacillus plantarum by pulsed electric fields[J].International Journal of Food Microbiology，2003，81：223-229.