体外透析法评定单胃动物饲料养分生物学效价

■陈 亮 张宏福 赵 峰

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室，北京 100193）

在畜牧业生产中客观、准确评定各种饲料原料的生物学效价是建立营养需要量标准，优化饲料配方的基础性科学决策依据，也是提高饲料利用率，降低饲料成本及节能减排的重要手段。饲料养分生物学效价（bioavailability）评定的宗旨是为了揭示饲料被畜禽采食后消化、吸收，经过动物循环系统进入相应的组织器官，再转化为畜产品的过程。在表达消化、代谢、转化的过程及其涵义方面，前人曾提出种种倡议，如表1所示。

养分生物学效价常利用动物体内（in vivo）实验进行评定。体内法既耗时费力，又受不可控的生理因素和实验条件而致结果迥异。因此，需要快速、可标准化的体外（in vitro）评定方法。在体外消化实验中，需采用不同的消化酶模拟不同段消化道的消化过程，并将己消化可吸收养分和不可吸收养分进行分离。期间离心、抽滤、沉淀和过滤等方法常带来较大的测定误差。透析方法自Thomas Graham 1861年首次提出至今已有100多年，并在各个领域广泛应用。在评定养分生物学效价方面，体外透析法（in vitro dialysis cell meth⁃od）也成为研究的热点，具体方法常以透析袋、透析液体系、搅拌器、恒温水浴为系统组成的胃肠模拟器。通常，在模拟饲料的消化时，先将一定重量的饲料装入三角瓶等容器中，加入模拟胃液后在恒温水浴摇床上振动消化一段时间，再将三角瓶中物质用碱中和后用模拟小肠液无损失地转移到透析袋中，再将透析袋放在流动透析液系统中继续消化。消化结束后直接测定透析袋中的物质（视为未消化物质）；或者收集和分析透析液，将透析液中的物质视为已消化物质。由于体外透析法将体外酶促反应和产物分离过程合二为一，使消化产物不断的去除，消除产物对酶促反应产生的抑制作用，这类似于动物肠道的吸收，从而可获取更加逼真的养分生物学效价的数据。

表1 饲料生物学效价定义

1 体外透析法的应用与发展

体外透析法的研究始于上世纪50年代，源于Mauron等(1955)的原创思想。将体外消化反应置于透析袋中进行，最初用于测定蛋白和氨基酸的消化率，对矿物质元素特别是磷的透析率的研究逐渐较多，近年来本实验室基于程控的仿生消化系统对饲料有效能的评定研究受到国内外同行关注。以下从饲料主要养分的评定方面对体外透析法进行综述，具体研究结果如表2所示。

表2 体外透析法的研究应用

Gauthier等(1982)和Savoie等(1986)建立了一套胃蛋白酶——胰酶去除产物消化法，测定蛋白质和氨基酸的消化率。据报道该法不仅可用于检测不同饲料中蛋白质的消化率，也能检出热处理对乳清蛋白中赖氨酸的破坏度和测定不同加工食物蛋白中氨基酸的体外消化率。该方法测定的粗蛋白质和氨基酸体外消化率和动物试验法表观消化测值呈现较好的相关性，因此，认为可以利用体外透析法测定的粗蛋白质和氨基酸消化率来预测表观消化率。在评定饲料蛋白质品质方面，该方法虽与未去除产物方法相比更科学合理，但未考虑到胆盐等对蛋白质消化率的影响。Handan等(2009)采用透析法，使用处理过的鱼消化器官（如：胃、十二指肠和盲肠等）作为酶源，引入胆盐和酸处理，测定蛋白饲料的生物学效价，并研究了如胃期消化时间、反应温度等影响因素。结果表明：与仅小肠期消化相比，加入酸处理氨基酸释放量增加两倍；添加胆盐可提高饲料蛋白质消化率约2.5倍，这可能由于胆盐可激活胰蛋白酶和糜蛋白酶原活性水解蛋白质。Drake等(1991)建立了胃蛋白酶—胰酶不连续体外透析法，在使用透析技术的基础上，引入了非内源性的高温淀粉酶，旨在使该体外消化模拟技术不但可用于测定饲料蛋白质的消化率，而且可对饲料淀粉消化率进行测定，进一步扩大评定饲料营养成分的范围。

体外透析法也用于评定饲料矿物质的生物学效价研究。Miller等(1981)首先利用体外透析法评定铁的生物学效价。在使用胃蛋白酶模拟小肠消化后，加入胰酶和胆汁模拟小肠消化；并在模拟小肠消化时，通过平衡透析法获取透析物，模拟了不溶性铁的消化和吸收，与体内铁和外源放射性铁的测值取得了很好的相关性。但存在透出物不及时移除，而产生较低的透析率。Minihane等(1993)使用连续透析法，将透出物不断的移除；pH值在30 min内自动调节。Promchan等(2005)，Shiowata⁃na等(2006)研发一种较为便捷的连续透析方法(dy⁃namic continuous- fl ow dialysis,CFD)，矿物质含量和透析液pH值可分别通过电热原子吸收光谱和pH计量器测定，并用该法测定牛奶中铁、钙的透析率。体外透析法评定磷的生物学效价的相关研究报道较多。Zyla等(1995)利用透析法获得的水解磷值与3周龄体重(R=0.986)、牙齿灰分(R=0.952)、摄入饲料量(R=0.994)和饲料报酬(R=0.992)等均具有强相关性；磷酸、蛋白酶和纤维素酶可增加体外透析磷的释放。Liu等(1997)采用体外透析法评定了10种植物性饲料磷的透析率，并建立了透析率与磷的表观消化率之间的回归关系，体外水解磷与体内磷的消化率和生长性能具有强相关(r=0.999)。方热军(2003)测定了19种植物性饲料和2种混合饲粮中磷的透析率，建立饲料可透析磷的预测模型。体外透析法也用于研究酶制剂对单胃动物饲料营养价值影响。利用体外透析法研究表明：添加植酸酶能提高动物磷的消化率；添加不同类型非淀粉多糖酶（如：木聚糖酶、β-葡聚糖酶或纤维素酶）可提高玉米日粮和双低菜粕日粮的生物学效价测值；并与体内的测试结果具有一致性。除了使用透析袋作为透析外，Wolters等(1993)使用中空纤维系统作为透析，研究评定矿物质和微量元素的营养价值，结果与Miller等(1981)测定Zn、Cu和Fe的透析率具有一致性。

从体外透析法的总体应用看，主要模拟胃和小肠的消化，常是先在酸性条件下进行胃的消化，再利用透析袋模拟小肠的消化和吸收。针对鸡的生理特点，有学者加入了嗉囊期的模拟；而进行猪的有效能评定时加入了大肠期。使用的消化酶常有胃蛋白酶、胰酶/仿生小肠酶以及大肠酶（如纤维素酶），也有采用处理过的消化器官组织作为酶源。这些研究中主要选用截留分子量为12 000～14 000 Da的透析袋居多。以猪饲料消化率测定研究为主，家禽次之，近年水生动物的研究报道逐渐增多。

2 体外仿生评定法关键影响因素评析

2.1 透析袋孔径

透析袋的孔径是影响饲料养分体外消化率的主要因素。Gauthier等认为，选用不同孔径的透析袋会导致分离出来的蛋白质消化产物分子量通常偏大或偏小，选用何种透析袋应该与畜禽消化道能够同时吸收氨基酸和小肽的实际情况相符。透析袋孔径大小对饲料养分消化率的影响与消化时间长短又有直接关系。采用不同孔径的透析袋在消化较长时间后，测定的体外消化率则无显著差异，这主要是随着消化时间的延长，大部分被分解成小肽段，均能够通过截留分子量较小的透析袋。也有报道认为饲料养分在体外消化过程中大部分仍是以大分子的形式存在，当采用孔径较大的透析袋时，粗蛋白和淀粉的消化率均显著高于截留分子量小的透析袋，如果采用截留分子量过小的透析袋，则会将一些在体内可消化吸收的养分人为地认为其为不可吸收部分。由于不同种类的动物消化道存在差异，透析袋的孔径也应该酌情筛选。如猪的食糜在消化道内的停留时间较长，大部分饲料养分以较小分子量的物质形式存在；而食糜在鸡消化道内的停留时间相对较短，有相当一部分饲料养分是以分子量较大的寡肽和寡糖形式存在。因此，在使用体外透析法评定养分生物学效价时，由于体外消化不可能完全模拟体内的情况，只有针对特定的饲料类型和模拟对象，选取适宜孔径的透析袋，避免千篇一律的模式，才能获得更加逼真的结果。

2.2 透析方式

从不同透析方法对蛋白质体外消化率的影响研究发现，增加透析液的更新频率也能够增加氮的消化率。而用间歇置换透析液的方法测得的蛋白质的消化率较低，尤其是置换透析液的间隔越长消化率越低。说明分解产物对酶促反应有显著的抑制作用，因此透析方式在体外消化模拟技术中非常关键。连续透析能够将蛋白质消化产物不断转移走，使透析袋内外始终保持较高的已消化养分浓度差，蛋白质消化率明显高于间歇透析。

2.3 模拟消化酶及消化液环境

针对不同动物、不同饲料养分应该采用相应的体外模拟酶及消化液环境，且这些条件应遵循动物体内消化的实际情况。消化酶种类、浓度、酶促反应时间、pH值、温度、透析液及其体积和流速等反应环境都会影响体外透析率。消化酶方面，各研究者主要选取胃蛋白酶和胰酶为主，认为它们为动物体内主要的消化酶，选用氨肽酶等太多的消化酶会引入更多的误差，影响氮的测定。这些重要参数的确立应兼顾方法的稳定性和反映动物体内的真实情况，以体内数据为支撑。一味追求体外消化率最大化或不切实际地追求与体内测值一致性而不顾方法的稳定性来确定模拟参数就会显得形而上学。同时，针对特定动物、饲料或日粮所获取的消化参数都是有条件性的，不可以偏概全。

3 单胃动物仿生消化系统

在诸多的国内外研究者报道的体外仿生技术，几乎都存在将胃蛋白酶消化饲料的混合物转移到透析袋的人工操作。组件基本上停留在烧杯或三角瓶、透析袋、摇床等传统设备。无论从仿生的角度及从所获参数的可比性与可重复性等方面都具有很大的局限性。虽也出现半自动化或自动化的消化装置，如荷兰TNO研制的猪全消化道仿生系统和加拿大2005年研制的人类上段胃肠仿生消化系统，但均引入了以中空纤维超滤管为吸收装置，不能反映养分消化生理及生物学效价评定中的“全进全出”的概念，仅用于胃肠道微生物生长、药理代谢、有害物残留等方面的研究。为此，本实验室从上个世纪后期开始，就仿生酶谱的设计定型的依据，消化过程中水解环境、消化液的加入、乃至水解产物的分离，饲料样品的制备、仿生酶消化系统、透析膜的筛选、饲料样本量与消化酶的配套用量、缓冲液的配制、反应温度、消化时长等因素的标准化与规范等方面的立论依据开展了系统研究，特别是创制了基于体外透析技术的程控“单胃动物仿生消化系统（Simulative Digestive System,SDS）”。与众多报道的体外透析法相比，该系统具有：体外酶消化的都在透析袋中进行，避免了不同消化期间反应物的转移损失而带来的测定误差；使用的消化酶均根据动物体内起主要作用的酶种类、浓度和比例，克服了选择酶谱的随意性；采用可程控系统能减少由于人工操作而引起的结果平行性差等缺陷。同时，该方法还使已消化养分与未消化养分复杂的分离过程简单化，并提高了重演性和相关性。

4 小结

以体外透析法为基点，是迄今研究创制饲料养分生物学效价简捷、标准化方法的方向，可为动物营养需要量研究和饲料营养价值评定提供一种“度量衡”基准和手段。但任何仿生方法的建立，还并不能实现比动物试验法更深入揭示养分在畜禽畜禽体内的消化、吸收和转化利用的情况，一味追求这种所谓“真实”状况也是动物营养学研究本身面临的现实难题。

（参考文献32篇，刊略，需者可函索）