发酵豆粕抗原蛋白的客观评价方法

2013-02-20蔡冬梅郭吉元杨海鹏周生飞马立周

饲料工业 2013年15期

■蔡冬梅郭吉元杨海鹏周生飞马立周

（1.山东和实集团有限公司，山东青岛 266100；2.山东新希望六和集团有限公司，山东青岛 266100）

豆粕作为一种重要的植物蛋白源，含有比较丰富齐全的营养成分，是畜牧业重要的蛋白资源，在饲料工业中有广泛的应用。但豆粕中含有多种抗营养因子，包括蛋白酶抑制剂、植物凝集素、大豆抗原蛋白、脲酶、植酸、大豆低聚糖等，它们的存在会在一定程度上影响动物对饲料养分的消化吸收和利用，造成畜禽生产性能的下降[1-2]。其中抗原蛋白是一种热稳定性的抗营养因子，是大豆中对动物（特别是幼龄动物）影响最大的一类物质。大豆抗原蛋白有4种，即11S球蛋白（大豆球蛋白）、7S球蛋白（β和γ伴球蛋白）和2S球蛋白（α伴球蛋白），其中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白是免疫原性最强的抗原蛋白，两者共占大豆总蛋白的65%～80%[3-6]。

发酵豆粕是利用微生物产生的丰富酶系来降解豆粕中的抗营养因子，并累积有益的代谢产物。发酵的主要目的之一就是降解大豆抗原，同时提高大豆多肽、游离氨基酸的含量，使产品具有较好的动物适口性，提高豆粕的利用率和营养价值[7-9]。国内已有多家企业开始发酵豆粕的生产和销售，但产品营养成分差异很大，品质良莠不齐，亟待制定一个发酵豆粕蛋白品质的客观评价方法[10]。

目前国内市场上对发酵豆粕抗原蛋白的评价主要是采用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，通过对比样品和豆粕原料中抗原蛋白的亚基条带分布，可以从一定程度上反映抗原蛋白的降解情况[11-12]。这种评价方法的关键在于样品的前处理方式，可浸提出的可溶性蛋白含量直接影响电泳结果的分析，不同厂家生产的发酵豆粕由于工艺不同导致溶解性差异很大，可溶于水的蛋白含量从2%到35%左右。如果用于电泳上样的蛋白质含量过低，就会显示出抗原蛋白降解良好的假象，所以需要同时检测样品中可溶性蛋白的含量[10]。而目前常用的几种提取液对大部分发酵豆粕蛋白的提取量都很有限，仅在5%左右，鉴于此，本研究改进了样品的前处理方式，提高样品提取液浸提出的蛋白含量，使电泳结果能真实地反映产品中抗原蛋白的降解情况。

1 材料与方法

1.1 试验材料

豆粕：市场购得，粗蛋白含量47%，粉碎，过60目筛。

发酵豆粕S、T、Y、J、D：市场收集，粗蛋白含量48%～50%，粉碎，过60目筛。

1.2 仪器和试剂

Bio-Rad蛋白电泳系统（Mini-Protean 3 Cell），凯氏定氮仪K9840（海能），分析天平等。电泳相关试剂由Bio-Rad公司提供，凯氏定氮试剂及Tris、SDS、β-巯基乙醇等均为国药产分析纯或化学纯试剂。

1.3 试验方法

1.3.1 样品提取液的配制

①去离子水（ddH2O）；②T1提取液：0.1 M Tris-HCl，pH 值 8.0；③T2提取液：0.03 M Tris-HCl，pH值8.0，添加0.01 M的β-巯基乙醇；④PSQ提取液：0.035 M PBS（含磷酸氢二钠10.91 g/l、磷酸二氢钠0.71 g/l、氯化钠9 g/l，pH 值7.6），添加1.5%SDS、0.1 M巯基乙醇（现配现用，SDS水浴加热溶解，待冷却后再加入巯基乙醇）[1,13-15]。

1.3.2 SDS-PAGE电泳试剂的配制

①丙烯酰胺储液(Acr/Bis)：丙烯酰胺 29.2 g，甲叉双丙烯酰胺0.8 g，ddH2O定容至100 ml，4℃保存。②10%SDS：SDS 10 g，ddH2O定容至100 ml。③1.5 mol/l Tris-HCl缓冲液（pH 值 8.8）：Tris 18.15 g，用HCl调pH=8.8，ddH2O定容至100 ml，4℃保存。④0.5 mol/l Tris-HCl缓冲液（pH值6.8）：Tris 6 g，用 HCl调 pH=6.8，ddH2O 定容至100 ml，4 ℃保存。⑤10×电泳缓冲液（pH值8.3）：Tris 30.3 g、甘氨酸 144.0 g、SDS 10.0 g，ddH2O定容至1 L。⑥10%过硫酸铵(APS)：APS 0.1 g，1 ml ddH2O溶解，分装后冻存于-20℃。⑦5×样品缓冲液：甘油2.5 ml，10%SDS 2 ml，0.5%（w/v）溴酚兰 0.2 ml，β-巯基乙醇 500 μl，0.5 mol/l Tris-HCl（pH值6.8）1.25 ml，ddH2O定容至10 ml。⑧染色液：考马斯亮蓝R-250 1.25 g，冰醋酸50 ml，甲醇200 ml，去离子水定容至500 ml，过滤后可反复多次使用。⑨脱色液：甲醇200 ml，冰醋酸100 ml，去离子水700 ml。

1.3.3 SDS-PAGE电泳凝胶的配制（见表1）

表1 分离胶和浓缩胶的组成

1.3.4 SDS-PAGE电泳方法

①样品处理：称取0.5 g精细粉碎的样品至20 ml样品提取液中，37℃振荡提取1 h，低温高速离心(10 000 r/min，20 min)。所得上清即可用于 SDS-PAGE。将40 μl上清与10 μl 5×样品缓冲液混合，沸水中煮5 min。标样与样品做同样处理。

② 电泳过程：用微量进样器取10 μl上样液，加于电泳孔中，200 V电压恒压电泳40 min。电泳完毕后将胶取下，用考马斯亮蓝染色液染色30 min，脱色液脱色摇床脱色。

1.3.5 蛋白含量的测定

各样品用样品提取液浸提出的蛋白含量用凯氏定氮法测定，其中T1和T2提取液中的Tris含有N元素，会对定氮结果产生影响，样品浸提出的蛋白含量需减去等量的提取液中的氮含量。

2 结果与分析

2.1 不同样品提取液浸提的蛋白含量(见表2)

由表2可知，豆粕用去离子水浸提后，提取出的蛋白含量为4.56%；用T1提取液提出的蛋白含量为12.24%，有所提高；T2提取液提出26.77%，可能是巯基乙醇的作用；用PSQ提取液在25℃条件下提取出42.42%，在37℃条件下可提取出47.90%。发酵豆粕S用T2浸提的蛋白含量为20.28%，T1比T2的盐离子浓度大很多，提出蛋白30.41%，用PSQ在37℃提出的蛋白达49.55%，几乎浸提出了豆粕中的所有蛋白质（豆粕中总蛋含量约43%～50%）。发酵豆粕T水溶性很好，用PSQ在37℃可提取出可溶性蛋白49.03%，发酵豆粕Y(Y-1、Y-2为不同批次的同一产品)、J、D用水和T1、T2浸提差异不大，但在PSQ盐溶液中都有很好的溶解性。由此可见，发酵豆粕类产品在优化的PSQ盐溶液中的溶解度比在其他几种提取液中有明显的提高。

表2 不同样品提取液浸提的蛋白含量(%)

2.2 不同样品提取液浸提后的电泳分析

将用不同样品提取液前处理所溶出的蛋白质进行电泳分析，结果见图1、图2。

图1 水和T1提取液处理的SDS-PAGE

图2 PSQ和T2提取液处理的SDS-PAGE

大豆抗原蛋白中的主要组分为7S球蛋白（亚基分子量分别为76、72、53 kD）和11S球蛋白（亚基分子量分别为35～40 kD、22 kD）。图1中泳道2～5是以去离子水为提取液进行浸提后的电泳结果，发酵豆粕S在20～30 kD之间显示有较浅的条带，发酵豆粕Y的两个样品都显示没有抗原蛋白残余。图1中泳道6～9是以T1提取液进行浸提后的电泳结果，条带颜色明显比2～5泳道深，发酵豆粕S在20 kD左右显示有大量的蛋白，发酵豆粕Y的两个样品也显示出有抗原蛋白残余。图2的2～7泳道是以PSQ提取液浸提后的电泳结果，电泳条带显示蛋白含量都较高，对比豆粕的条带可知，发酵豆粕S的抗原蛋白有部分降解，发酵豆粕T的发酵比较彻底，基本没有抗原蛋白的残余，而发酵豆粕Y、J、D都显示出与豆粕相同的条带，降解不明显。图2的8～11泳道是以T2提取液浸提后的电泳结果，与图1的2～5泳道结果相似，除豆粕的蛋白含量明显高于图1，其余三个样品和图1一样，没有显示出明显的抗原蛋白亚基条带。

3 讨论

抗原蛋白的电泳结果和样品提取液浸提出的蛋白含量密切相关，提取出的蛋白含量越高，才越能真实地反映发酵豆粕中抗原蛋白的降解情况和分子量分布。天然大豆蛋白的水溶性很好，但是豆粕在加工过程中的某些处理方式导致了蛋白质溶解度的大大下降，樊春光等[10]研究表明，某些发酵豆粕由于干燥温度过高，蛋白质不能提取，上样时蛋白质浓度很低，会出现SDS-PAGE显示蛋白降解很好的假象。如果一个发酵豆粕样品电泳显示蛋白降解很好，但水溶性蛋白含量很低，则需改进样品提取方法进一步检验。

针对以上问题，本文优化了抗原蛋白的提取方式，采用4种样品提取液对市面上的几种发酵豆粕产品进行了处理和电泳分析。如表2所示，水为提取液浸提出的蛋白含量最低，0.03 M Tris-HCl+巯基乙醇（T2）提出的蛋白含量和水提相差无几，巯基乙醇能破坏蛋白质分子中的二硫键，因而豆粕在T2提取液中的溶解度略高，但是几种发酵豆粕的溶解性变化不大。而在0.1 M Tris-HCl提取液中（T1），由于溶液离子浓度的增强，发酵豆粕S的溶解性大幅提高，提出蛋白含量达30.41%，但是豆粕和其他几种发酵豆粕产品溶解性提高幅度较小。PSQ提取液在37℃条件下提取的蛋白含量最高，其中的巯基乙醇和SDS（破坏氢键和疏水键）有效地提高了蛋白质的溶解性。本研究还尝试了在提取液中添加尿素（破坏氢键），但是由于溶液离子浓度过高且影响蛋白质含量测定，所以未采用（数据未显示）。图1、图2的电泳结果表明，样品蛋白质的提取方式直接影响了结果分析，发酵豆粕S用去离子水和T2浸提后只在20～30 kD之间显示出很浅的电泳条带，而用T1和PSQ浸提后在20 kD左右显示出大量的蛋白，7S球蛋白的三个亚基和11S球蛋白的酸性链部分降解。发酵豆粕Y-2用去离子水和T2浸提后电泳无条带，显示出抗原蛋白完全降解的假象，但该样品的可溶性蛋白只有4.02%和5.29%，当可溶性蛋白为6.45%时（T1提取）电泳显示出两条较浅的亚基带，而当可溶性蛋白达39.42%时（PSQ提取）电泳显示出与豆粕相似的条带，表明该样品抗原蛋白并无明显降解。发酵豆粕T用PSQ浸提后电泳显示无条带，同时该样品的可溶性蛋白为49.03%，表明该样品确实发酵彻底，抗原蛋白基本完全降解。