运用体外法评定不同微生物制剂对稻草处理效果

2013-02-20付戴波许宇薇瞿明仁游金明欧阳克蕙宋小珍易中华

饲料工业 2013年17期

■付戴波许宇薇瞿明仁游金明欧阳克蕙宋小珍易中华

（江西农业大学江西省高校动物营养与饲料重点实验室，江西南昌 330045）

江西省是我国水稻种植大省。气候条件优越，雨热同季，适宜水稻生长，稻草产量巨大，但利用率过低，主要利用方式为作为肥料还田或直接燃烧，作饲料用的仅占16.2%，远低于其他秸秆的饲料利用率（22.6%），而被焚烧和弃置的占10.9%，资源浪费和环境污染严重。稻草是一种常见的粗饲料，粗纤维含量在30%以上，蛋白含量仅为3%～5%，适口性差，家畜采食量低，营养价值过低，饲用价值不高。因此，如何充分合理有效地利用作物秸秆，是当代农业发展的一个重大课题。本试验采用不同微生物制剂对稻草进行处理，研究其在瘤胃体外发酵指标影响，探讨适宜的稻草微生物制剂或组合，旨在为稻草充分利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与管理

选择在江西农业大学动物营养研究基地牛场体况良好，装有永久性瘤胃瘘管的3头锦江黄牛，体重300 kg左右。单舍饲养，其日粮由精料与粗料组成，精粗比为2∶8，基础日粮为玉米-麦麸-稻草型，精料购于江西华达牧业有限公司，精料的配方组成为玉米、麦麸、豆粕、棉粕、碳酸钙、磷酸氢钙、食盐、维生素（A、D3、E、烟酸）微量元素（CuSO4、FeSO4、ZnSO4、MnSO4、NaSeO3、KI、CoCl2）及防霉剂等。表1为试验牛日粮组成及营养水平。于每日早8点与晚8点饲喂日粮，先粗后精，自由饮水，试验期间采集试验牛瘤胃液供体外培养。

表1 试验日粮组成及营养水平

1.2 试验材料

稻草：试验所用稻草取自江西农业大学动物营养实验室牛场。

添加剂：从市场选用A、B、C 3种微生物处理剂，其主要有效成分如表2所示。

表2 微生物制剂主要成分及添加量

1.3 试验设计

试验采用单因子重复设计，采用3种添加剂及其不同组合，共7种处理，每个处理设2个重复。7种处理组分别为：A处理组、B处理组、C处理组、A+C处理组、B+C处理组、A+B处理组、A+B+C处理组。

1.4 体外批次培养装置

培养装置主体为恒温水浴摇床，水浴温度和震荡频率可调，酸奶瓶（容积为150 ml）作为培养瓶，瓶口安装带塑料管的橡皮塞，同时，塑料管带有可打开和关闭的塑料三通阀以保证厌氧环境，塑料三通管与医用注射器相连接。试验前所用培养瓶，注射器及玻璃器皿均用超声波清洗仪清洗，高压灭菌，烘干备用。

1.5 人工瘤胃营养液的配制

缓冲试剂和常量元素溶液(A液)：称取K2HPO4382.51 mg、KH2PO4292 mg、(NH4)2SO4480 mg、NaCl 200 mg、MgSO4·7H2O 100 mg和Na2CO34 000 mg，将上述试剂混合后加入蒸馏水定容至1 000 ml。该溶液使用前1 d配制待用。

微量元素溶液（B液）：准确称取EDTA 500 mg、FeSO4·7H2O 200 mg、MnCl·4H2O 200 mg、ZnSO4·7H2O 10 mg、H3BO330 mg、CoCl2·6H2O 20 mg、Cu-Cl2·6H2O 1 mg、NiCl2·6H2O 2 mg和NaMoO43 mg，将上述试剂混合后加蒸馏水定容至1 000 ml。持续通入CO218 h后，盖严瓶口，至于冰箱备用。

还原剂溶液（C液）：称取25 g Na2S·9H2O加入80 ml蒸馏水溶解后定容至100 ml，持续通入CO220 min后，盖严瓶口，置于冰箱中备用。

人工瘤胃营养液制备：准确量取790.4 ml A液，8 ml B液，经充分混合后持续通入CO218 h，于培养前1 h加入1.6 ml C液，充分混合，分装到培养瓶中，每个培养瓶中分装40 ml，通入CO2气体5 min，装上安有三通阀的橡皮塞，三通阀处于关闭状态，放于恒温水浴摇床中预热至39℃待用。

1.6 瘤胃液的采集与制备

于早8：00晨饲后在3头试验牛瘤胃的上下左右不同点各采集400 ml瘤胃液，经4层纱布过滤后装入预热至39℃并通有CO2气体的保温瓶中，迅速返回实验室，使用39℃预热的量筒量取所需瘤胃液分装到培养瓶，每个瓶中分装20 ml瘤胃液，一份瘤胃液加入两份缓冲液中，混合均匀，接通培养瓶和注射器，打开三通阀，开启震荡开关，进行体外培养。

1.7 体外培养试验

准确称取7组微生物制剂处理稻草样品4 g，转移入已装有人工瘤胃液的培养瓶中，然后进行0、12、24、36、48 h四个时间点的体外批次培养，每个时间点每个处理设4个重复，在相应设置时间点取出处理的所有培养瓶，将样品预处理，进行相关指标的测定。正常稻草作为对照组。

1.8 测定指标与方法

产气量测定：分0～6、6～12、12～24、24～36、36～42 h等5个时间段，记录每个时间段产气量。

氨态氮测定：参照冯宗慈《通过比色测定瘤胃液氨氮含量方法的改进》（比色法）方法测定。

BCP测定：采用王放（1990）改进方法测定。取去除原虫和饲料大颗粒的上清液10 ml，以16 000×g离心20 min，弃去上清液，沉淀部分加入9 ml 10%三氯乙酸溶液，混匀，再以4 000 r/min离心10 min，取沉淀物加入5%氢氧化钠溶解，然后稀释至25 ml。此稀释液又经4 000 r/min离心10 min，取上清液在紫外分光光度计上用280 nm和260 nm波长进行比色。应用下面公式求得细菌蛋白质含量：

细菌蛋白质含量（mg/ml）=(1.45×D280-0.74×D260)×稀释倍数。

1.9 数据处理

试验数据基本处理采用Excel软件，结果分析先采用SPSS17.0中One-way-ANOVA进行方差分析，并利用Duncan程序进行均值的多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同微生物制剂及组合处理微贮稻草对体外培养产气量的影响

不同处理微贮稻草对体外培养产气量的影响测定结果见表3。总体来看，各处理组产气规律大致相似，产气量均呈先上升后下降的趋势。以培养6～12 h各组产气量达到最大值，随着培养时间的延长，产气量逐渐下降。

表3 不同微生物制剂对稻草体外培养产气量的影响(ml)

从各培养时间段来看，培养0～6 h处理A、C、B+C、A+B组产气量显著高于对照组（P＜0.05），处理A+B组产气量最高，为12.25 ml。培养6～12 h后，处理A、A+C、B+C、A+B组产气量均显著高于对照组（P＜0.05），以处理A+B组产气量最高，为16.50 ml。培养12～24 h各组产气量开始下降，但处理A、B+C、A+B组产气量仍显著高于对照组（P＜0.05），以处理A组产气量最高，为9.00 ml。培养24～36 h各组产气量持续下降，处理A+C组产气量低于对照组，但差异不显著（P＞0.05），其他处理组产气量均高于对照组，处理A、B+C、A+B组产气量显著高于对照组（P＜0.05）。体外培养36～48 h，各组产气量降到最低，处理B、A+C、B+C组产气量低于对照组，但差异不显著（P＞0.05），其余处理组产气量高于对照组，其中处理A组产气量显著高于对照组（P＜0.05）。

从3种不同微生物制剂及组合来看，以A制剂总产气量最大，C次之，B最小；从组合来看，A+B组合总产气量最大，然后依次为B+C、A+C、A+B+C。

2.2 不同微生物制剂及组合处理微贮稻草对培养液中氨态氮浓度的影响（见表4）

表4 不同微生物制剂对稻草培养液中NH3-N浓度的影响（mg/100 ml）

总体来说，无论是对照组还是微生物制剂处理组，培养液中NH3-N浓度均随培养时间的延长呈逐步下降趋势。

从各组来看，培养6 h后，除A组NH3-N浓度比对照组低（但差异不显著，P＞0.05）外，其余各处理组均比对照组高，其中A+B+C组NH3-N浓度最高，而且显著高于对照组和其他组（P＜0.05）；培养12 h后，B、C、A+B、A+C、A+B+C组显著高于A组和对照组（P＜0.05），A+B+C组NH3-N浓度最高。培养24 h后，A+B+C组NH3-N浓度最高，并显著高于其余处理组和对照组（P＜0.05），以A组最低但与对照组差异不显著（P＞0.05）；培养36 h和48 h，仍然以A+B+C组NH3-N浓度最高，并显著高于其余处理组和对照组（P＜0.05），以A最低，但与对照组差异不显著（P＞0.05）。

2.3 不同微生物制剂及组合处理微贮稻草对培养液中BCP浓度的影响

不同微生物制剂处理稻草体外瘤胃培养液中BCP含量测定结果见表5。从各时间点来看，BCP浓度均随培养时间的延长而升高，每个时间点处理组BCP浓度均高于对照组。6 h以B组BCP浓度最高，12、24、36、48 h四个时间点以A+B+C处理组BCP浓度最高。各组以0～24 h培养液中BCP浓度上升较快，24～48 h培养液中BCP浓度仍然呈上升趋势，但是上升速度较慢。

表5 不同微生物制剂对稻草培养液中BCP浓度的影响（mg/100 ml）

从各组BCP浓度来看，培养6 h B组BCP浓度最高，而且显著高于B+C组(P＜0.05)，其余各理组BCP浓度与对照组相比均有所升高，但差异不显著(P＞0.05)，且各处理组之间差异也不显著。培养到12 h，处理A、B、C、A+B+C组的BCP浓度显著高于对照组(P＜0.05)，以A+B+C组的BCP浓度最大，达到13.42 mg/100 ml，比对照组高出2倍；培养24 h后，处理C、A+C、A+B、A+B+C组BCP浓度显著高于对照组（P＜0.05），同样以A+B+C组的BCP浓度最大，同时显著高于A、B、C、B+C组（P＜0.05）。其余各处理组BCP浓度差异不显著（P＞0.05）；培养36 h后，各处理C、A+C、A+B、A+B+C组BCP浓度显著高于对照组（P＜0.05），以A+B+C组的BCP浓度最大，同时显著高于A、B、C、B+C组（P＜0.05）。其余各处理组BCP浓度差异不显著（P＞0.05）；培养48 h后，A+C、A+B、A+B+C显著高于对照组（P＜0.05），也是以A+B+C组的BCP浓度最大，A、B、C、B+C组与对照组差异不显著（P＞0.05）。

2.4 不同微生物制剂及组合微贮稻草对培养液中产气量、氨氮、BCP浓度相关性分析

对上述不同处理微贮稻草对培养液中48 h总产气量、BCP含量、氨氮浓度相关性分析，得出如下回归方程：

①Y=-0.061 3X+9.010 8（Y为培养液中NH3-N浓度，X为48 h总产气量，R2=0.187 8）。

② Y=0.110 9X+12.315（Y为培养液中BCP浓度，X为48 h总产气量，R2=0.102 8）。

③ Y=1.214X+10.232（Y为培养液中BCP浓度，X为培养液中NH3-N浓度，R2=0.677 8）。

从上述相关性分析可见，培养液中BCP浓度与NH3-N浓度呈现中等相关，相关系数R2为0.677 8。而培养液中NH3-N、BCP浓度与48 h总产气量呈现弱相关，相关系数R2分别为0.187 8、0.102 8。

3 讨论

3.1 不同微生物制剂处理稻草对体外培养产气量的影响

本研究发现，微生物制剂A、C及A+B组合处理组的产气量高于对照组，其中处理A组显著高于对照组（P＜0.05），说明单独使用A、C或A+B组合微生物制剂对稻草进行发酵均有促进作用，有可能提高稻草有机物质的消化率。

不同的微生物制剂由于菌种或活性物质不同，其对稻草体外培养产气量有不同影响，本研究结果表明：以A制剂总产气量最大，C次之，B最小；不同的微生物制剂之间存在组合效应，各组合产气量依次为A+B、B+C、A+C、A+B+C。A+B组合总产气量最大，处理稻草后培养发酵最激烈，有可能稻草的有机物质消化率最高，实际情况如何有待进一步研究。

3.2 不同处理微贮稻草对培养液中氨氮、BCP浓度的影响

氨氮浓度一定程度上反映了瘤胃微生物分解含氮物质产生NH3的速度以及微生物对NH3利用情况。瘤胃液中的氨是蛋白质在微生物降解和合成过程中的重要中间产物。瘤胃微生物中，大约有80%的细菌以氨作为氮源。瘤胃内氨浓度过低，瘤胃微生物生长缓慢，碳水化合物的分解利用也受阻。反之，如果合成速度比降解速度快，则氨会在瘤胃内积聚并超过微生物能利用的最大氨浓度，以尿的形式排出，造成氨的浪费。因此，瘤胃内适当的氨氮浓度是保证瘤胃微生物蛋白合成效率的重要条件。有学者研究表明，瘤胃微生物生长最适的NH3-N浓度为5～28 mg/100 ml。本试验发现，3种微生物制剂及其组合处理组，各时间点NH3-N浓度均比对照组高，而且均在瘤胃微生物生长最适的NH3-N浓度范围内。3种微生物制剂及其组合处理组BCP浓度均比对照组高。对照组稻草未经微生物处理，NH3-N浓度偏低，不能为瘤胃微生物提供充足的氮源，因此，其BCP浓度在各时间点都很低。从培养液中BCP浓度与NH3-N浓度相关性（呈现中等相关R2=0.677 8）也说明了这一关系。

从3种微生物制剂及其组合NH3-N、BCP浓度总体来看，单独使用以C制剂最好，联合使用以A+B+C组合最好。其原因可能是微生物制剂及其组合处理稻草，促进了微生物的大量繁殖，分泌的纤维素酶降解了稻草细胞壁，分解纤维物质，得到更多的营养物质，为瘤胃微生物合成BCP提供大量的氮源及能量。